实验三 重组质粒DNA转化大肠杆菌ppt课件

实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验目的,学习将重组质粒DNA导入大肠杆菌的方法学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法为下一步重组体筛选做准备,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验原理,遗传学中转化的基本含义是使细胞获得一新的可遗传的表型性状。分子克隆中用人工的方法将重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞，使携带有重组质粒的大肠杆菌获得在抗生素平板上生长的能力，从而与不携带重组质粒的的细菌区分开来，这个过程就是转化。将重组质粒转化进受体细菌时，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。大肠杆菌细胞经过一些特殊方法（电击法、CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞即感受态细胞(Competentcells)。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。0.1mol/LCaCl2是一种低渗溶液，在0低温处理大肠杆菌细胞时，细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击（如42）下，细胞可吸收外源DNA。为了鉴定这些转化子，须利用质粒编码的筛选标记，这些标记赋予细菌新的表型，是成功转化的细菌很容易被筛选出来。pET32a质粒带有氨苄西林抗性基因（Ampr），其重组体转化的大肠杆菌能够在含氨苄西林的培养基上生长，而未转化的受体菌则不能再这种培养基上生长。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,Ampr：氨苄西林抗性基因内酰胺酶,多克隆位点（MCS）：外源DNA片段的插入位点,Amps菌株,Ampr,涂布于含Amp的培养基上，可以生长。次日可见白色菌落-转化子。,培养基上含有X-Gal和IPTG时，可使用蓝白斑筛选方法鉴别真正的重组的转化子。,pET32a,pET32a,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,结构的三大要素：多克隆位点选择标记（耐药性，LacZ）复制起始位点种类：质粒噬菌体酵母人工染色体（YAC）反转录病毒载体表达载体等,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,pET-32aVector,ThepETSystemisthemostpowerfulsystemyetdevelopedforthecloningandexpressionofrecombinantproteinsinE.coli.,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,pET-32cloning/expressionregion,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,Vector(pET-32a),Genefragment(SmPR10),pET32a-SmPR10,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,材料、设备及试剂,材料E.coliDH5菌株:R-、M-、Amp-(转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。）pET32a-SmPR10质粒DNA（浓度：2ng/l):实验室自制设备恒温摇床；电热恒温培养箱；台式高速离心机；超净工作台；低温冰箱；恒温水浴锅；分光光度计；微量移液枪。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,试剂1、LB固体和液体培养基LB培养基配方：（单位g/L）胰蛋白胨10酵母提取物5NaCl10琼脂粉（1.5%）15g（注：LB液体培养基不加琼脂粉）按配方称量药品,加入一定量的ddH2O后置电炉上加热熔解琼脂，待琼脂完全熔解后加入ddH2O定容至1000ml,用NaOH调节pH至7.0。121湿热高压灭菌20分钟，待冷却至60左右,在超净工作台中加入一定量的Amp储存液,使终浓度为100g/ml,摇匀后用培养皿铺板。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,2、Amp母液：称取氨苄西林100mg溶于1mlddH2O中，0.22m滤器过滤除菌，用1.5ml离心管分装后储存于-20冰箱.3、0.1mol/LCaCl2溶液:称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至100ml,用0.22m滤器过滤除菌或高压灭菌。EP管分装于4冰箱储存.4、pET32a-SmPR10质粒：实验室自制,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,操作步骤,（一）受体菌的培养1、取-70或-20贮存的大肠杆菌DH5菌种，在LB培养液中培养过夜，进行活化;2、取几微升活化后的菌液（取量视菌的密度而定）在LB平板上涂布,于37培养箱中培养24h；从LB平板上挑取单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。3、将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于LB液体培养基中,37振荡培养2-3小时至OD6000.5左右(生长对数期）。（注：这一步非常关键。培养过度的菌液含有较多的“老”细胞，制备成感受态细胞后其接受外援DNA能力较低，从而导致转化率降低。）,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,（二）、感受态细胞的制备(CaCl2法)1、将菌液转入1.5ml离心管中,冰上放置10分钟,然后于4、4000rpm离心10分钟。2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上放置10分钟后,4、4000rpm离心10分钟。3、弃去上清,加入0.1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞。每份100l（注意悬液密度要均匀）,冰上放置备用。4、暂时不用的感受态细胞可置于-80保存。,注：CaCl2处理后的细胞比较脆弱，尽量温柔操作！,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,（三）重组质粒DNA的转化质粒和感受态细胞混和：在100l感受态细胞悬液中加入5l重组质粒DNA（pET32a-SmPR10），轻轻混匀后冰上放置30分钟。热击：42水浴中热击60秒（注：精确计算时间，热击过长将对细胞造成伤害）,热击后马上置于冰上冷2-5分钟。复苏：向每管中加入800lLB液体培养基(注：不含Amp),混匀后在37150rpm轻摇培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr)。,思考：热击后的细胞已吸入外源质粒，如本实验中的pET32a，该质粒可赋予宿主氨苄青霉素抗性。但是为什么复苏时用的LB培养液不加Amp？,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,（四）涂布平板筛选转化质粒将管中培养液摇匀后取100l均匀涂布于含Amp的筛选平板上。（注：将培养液摇匀后涂布。）2.正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37温箱中培养过夜，次日观察实验结果。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,预期实验结果,感受态细胞+重组质粒,0.1MCaCl2+重组质粒,感受态细胞+无菌水,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验报告,思考题(1).根据本实验你认为影响转化率的因素有哪些？(2).如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,实验中要考虑的重要因素,为了提高转化效率,实验中要考虑以下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度:不要用经过多次继代或储于的培养菌，最好从-70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。,实验三重组质粒DNA转化大肠杆菌,2.质粒的质量和浓度:用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。10ng的cccDNA即可使100l的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。3.试剂的质量:所用的试剂，如CaCl2等均