核酸分子杂交技术PPT课件

.,1,分子生物学检测技术,核酸分子杂交技术PCR技术,.,2,核酸分子杂交技术一、核酸分子杂交的定义及基本原理,定义：具有互补序列两条单链核酸分子在一定条件下按碱基互补配对原则退火形成双链的过程。杂交有固一液相杂交和液相杂交。,.,3,核酸分子杂交的基本原理,DNA链与DNA链、DNA与RNA链、RNA与RNA链之间，只要具有一定的互补碱基序列就可以在适当的条件下相互结合形成双链，用已知的DNA或RNA片断来检测未知的DNA或RNA片断。杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。,.,5,二、核酸分子杂交的探针,（一）探针的种类1、根据组成分类,基因组DNA探针cDNA探针RNA探针寡核苷酸探针,.,6,2、标记物3、标记的方式,放射性同位素标记法如32P、3H、35S非放射性同位素标记法如金属、半抗原、荧光素体内标记法体外标记法化学标记法酶促标记法,.,7,DNA探针,DNA探针是最常用的核酸探针指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针，多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针,.,8,DNA探针,最常用的核酸探针长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列DNA片段须是特异的（仅与靶DNA或RNA结合）来源广泛（微生物或动物、人类的细胞）,.,9,DNA探针的主要优点,这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记,.,10,cDNA探针,cDNA（complementaryDNA）是指互补于mRNA的DNA分子。mRNA互补DNA,逆转录酶的DNA聚合酶,逆转录酶的RNaseH,DNA聚合酶,分解mRNA,第二条CDNA链,.,11,.,12,.,13,RNA探针,1、RNA探针是单链分子，与靶序列的杂交反应效率高。2、早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率不高，且受到多种因素的制约。3、体外逆转录可高效合成RNA，加入标记物可成为探针4、应用：例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）的基因组DNA克隆时，因无DNA探针可利用，就利用HIV的全套标记mRNA作为探针，成功地筛选到多株HIV基因组DNA克隆。,.,14,寡核苷酸探针,利用寡核苷酸自动合成仪，可很简单地合成制备寡核苷酸探针(如1550bp)，寡核苷酸探针的优点：短的探针比长探针杂交速度快，特异性强。可以在短时间内大量制备。在合成中进行标记制成探针。可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。寡核苷酸探针可以检测小DNA片段。,.,15,（二）探针的标记1、理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,.,16,2、标记物（1）理想标记物应具备的特性：,高度灵敏性不影响碱基配对的特异性不影响探针分子的主要理化性质对酶促反应活性无影响或影响不大检测方法具有高度灵敏性和高度特异性,.,17,（3）标记物种类,核素标记物：32p、35s、3H非核素标记物半抗原：生物素、地高率配体：生物素是亲和素的配体荧光素：异硫氰酸荧光素、罗丹明等化学发光探针：标记物与某种底物反应发光，如生物素酰化的碱性磷酸酶可使发光底物发光,.,18,（3）标记方法体内标记法：将核素标记的化合物作为合成代谢的底物，在细胞合成代谢时使核素掺入到新合成的核酸分子中，如3H-胸苷可掺入到DNA中，3H-尿苷可掺入到RNA中,.,19,体外标记法：化学标记法：标记物分子上的活性基团与探针分子上的某些基团反应，标记物直接结合到探针分子上酶促标记法：标记物预先标记核苷酸，然后利用酶促法将标记的核苷酸掺入到探针上,.,20,酶促标记法切口平移法（nicktranslation),利用DNaseI在DNA双链上造成单链切口利用大肠杆菌DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以互补的DNA单链为模板依次将dNTP连接到切口的3末端-OH上，合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中,.,21,.,22,.,23,.,24,.,25,.,26,随机引物法,其原理是随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性核素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,.,27,随机引物法所具有的优点：1、能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记2、操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题3、标记活性高，标记活性可达108cpm/gDNA以上4、可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记,.,28,PCR标记法：将标记的核苷酸作为PCR反应的底物，以待标记的DNA为模板，经PCR反应，标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中,.,29,.,30,（三）探针的纯化1、乙醇沉淀法：无水乙醇可以沉淀DNA片段，可去除dNTP和蛋白质2、凝胶过滤柱层析法：利用凝胶的分子筛作用，将大分子DNA和小分子dNTP、磷酸根离子及寡核苷酸（80bp)等物质分离，常用凝胶基质是SephadexG-503、微柱离心法：其原理与上述凝胶过滤柱层析法相同，不同的是上述采用洗脱的方式纯化探针，而此法则是利用离心的方式来纯化探针,二、影响杂交的因素1、核酸分子的浓度和长度：浓度越大，复性速度越快分子越大，复性速度越慢单链探针，浓度增加，杂交效率增加双链探针，浓度控制在0.10.5g,浓度过高影响杂交效率,2、温度：（1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低2025（2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低Tm值（3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5,3、离子强度：（1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加（2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度,4、甲酰胺：（1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在3542杂交（2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68杂交,5、核酸分子的复杂性：（1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度（2）Cot与反应体系中核酸复杂性成正比（3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性,6、非特异性杂交反应：（1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附（2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉,三、核酸分子杂交的方法按待测核酸是否固定在固相支持物上分：固-液相杂交膜上印迹杂交原位杂交液相杂交RNA酶保护分析法核酸酶S1保护分析法,.,38,带有DNA片段的凝胶,Southern印迹杂交的技术流程,（一）Southern印迹杂交1、待测核酸样品的制备（1）裂解或破碎细胞（2）抽取纯化基因组DNA（3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段,2、待测DNA样品的电泳分离（1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶分离小片段用高浓度胶（2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子DNA泳动慢,小分子DNA泳动快，大小相同的分子处于同一条带（3）分子量标准：经Hind消化的DNA，杂所用分子量标准可用核素标记,3、凝胶中核酸的变性（碱变化）凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的单链DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液,4、Southern印迹指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。,（1）固相支持物的选择理想的固相支持物应具备的特性：具有较强结合核酸分子的能力不影响与探针的杂交反应与核酸分子结合稳定牢固具有良好的机械性能非特异吸附少,常用的固相支持物硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本底低。缺点是DNA分子结合不牢固尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能力较上述两种膜低,Southern印迹的常用方法（1）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上,.,46,。,（2）电转法,利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。,.,48,（3）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,.,50,5、Southern杂交（1）预杂交：封闭膜上能与DNA结合的位预杂交液为不含DNA探针的杂交液（2）杂交：液相中的DNA探针与膜上的待测DNA双链DNA探针需加热变性为单链，再杂交（3）洗膜：去除游离的放射性探针或非特异结合的DNA,6、杂交结果检测（1）放射自显影：适用于放射性核素标记的探针（2）比色或化学发光检测：适于非核素标记的探针,7、Southern杂交的应用（1）酶切图谱分析（2）特定基因定性和定量（3）基因突变分析（4）限制性片段长度多态性的分析,（二）Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNA,Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA,（三）斑点及狭缝印迹杂交1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量,（四）原位杂交1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交,保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定,2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：,（2）组织细胞杂交前的预处理,去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落,（3）探针的