高效液相色谱测定肉制食品中五种邻苯二甲酸酯

高效液相色谱测定肉制食品中五种邻苯二甲酸酯资料来源：中国增塑剂网王美丽，陈海婷，张会娜，郭智勇，魏丹毅(宁波市新型功能材料及制备科学国家重点实验室培育基地，宁波大学材料科学与化学工程学院，宁波)摘要:建立了肉制食品中5种邻苯二甲酸酯类增塑剂(PAEs)含量的检测方法。样品用正己烷提取，C18柱分离，柱温35.0，乙腈-水为流动相梯度洗脱，流速1.0mL/min，紫外检测波长226nm。5种PAEs分离特异性好，在0.0210g/mL之间均具有较好的线性关系，检出限在4.413.8ng/mL之间，高、中、低3水平的回收率均在79.5%102.0%之间，相对标准偏差均在1.1%14%之间。方法适用于肉制食品中邻苯二甲酸酯类的检测。关键词：邻苯二甲酸酯；高效液相色谱；肉制食品食品容器和包装材料增塑剂包括邻苯二甲酸酯类(PAEs)、己二酸酯类(AEs)等。增塑剂与塑料间并没有严密的化学结合键，故很容易进入环境。近年的研究表明：PAEs和AEs在体内长期累积，可致畸、致癌和致突变1,2。因此，增塑剂的分析检测受到重视，尤以PAEs为研究对象居多。目前，PAEs的检测技术主要采用薄层色谱法3、气相色谱法46、液相色谱法714、气-质联用法15,16,样品处理技术主要有液-液萃取3,8,14,15、固相萃取4,5,9,11,16以及固相微萃取6,7,12,15等,涉及的基体主要为PVC塑料3,4,6,15、环境样品(如水、泥土)5,8,13,16、组织和血浆7,8,10,15、食品12,14等。食品因直接被摄入而危害更大，报道过的研究对象主要包括：水产品、牛奶、食用油等。肉制食品的脂肪含量高，PAEs在其中的溶出程度尤为严重，但至今未见相关检测方法报道。 本文以邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸正二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸正二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)、邻苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)等5种PAEs为研究对象,建立了高效液相色谱法测定肉制食品中PAEs的方法。方法重现性好，准确度高，可用于肉制食品中此类物质的测定，也可用于生产企业的质量控制。1 实验部分1.1 仪器与试剂 戴安P680C高效液相色谱仪，包括：P680型四元梯度泵，TCC-100型柱温箱，ASI-100型自动进样器，UVD170U型紫外检测器，Chromeleon色谱工作站；AB104-N型电子天平；XHF-D型高速分散器；SK-1型涡旋混匀器；DS180A型超声波清洗机；Heraeus Primo R高速冷冻离心机；D10-12型氮气吹扫仪；Heal Force PW超纯水系统。DEP、DBP、DEHP、DOP标准品(Sigma-Aldrich)，BBP标准品(TCI)，乙腈(HPLC级)、正己烷(Fisher)，水为超纯水。1.2 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Luna C18柱(250 mm4.6mmi.d.，5m)；预柱：Phenomenex C18柱(4mm3mm，5m)；紫外检测波长；226nm；柱温:35.0；进样体积20L；流动相：乙腈-水；流速：1.0mL/min；梯度洗脱，步骤如下表1所示。1.3 标准溶液配制分别称取DEP、BBP、DBP、DEHP、DOP标准品各00500g，分别用乙腈定容于50mL容量瓶中，配成1mg/mL的5种PAEs的储备液。准确移取5种PAEs的储备液各100.0L，置于同一10mL容量瓶中，用V(乙腈)V(水)=7525的混合溶液定容,配成10.0g/mL的混合标准应用溶液。再用水逐级稀释，配成2.0、1.0、0.20、0.10、0.020、0.010g/mL的混合标准应用溶液。1.4 样品处理 准确称取已切碎的火腿肠0.5g于试管中，加入正己烷2mL，匀浆，涡旋振摇3min，超声提取15min，在-10下10000r/min离心10min，取清液；同法再萃取1次，合并2次清液，45下氮气流吹干，用乙腈0.5mL溶解残渣，经0.45m微孔滤膜过滤后，进样。以生产日期不超过15天，距离表面1cm以上的内层肉制品作为空白。2 结果与讨论2.1 色谱条件的选择 PAEs在205、226和272nm处有3个特征吸收峰，吸收强度依次增大，但272nm处杂峰干扰较多，综合考虑吸收强度及干扰因素，选择226nm作为检测波长。 以纯乙腈作为流动相时，BBP和DBP、DEHP和DOP两两未能达到完全分离，增加流动相中水的含量，5种PAEs能完全分离，但DEHP和DOP的出峰时间增长，当以V(乙腈)V(水)=7525的流动相等度洗脱时，DOP的出峰时间超过了50min，故考虑采用梯度洗脱。在如表1所示条件下5种PAEs完全分离，出峰时间控制在22min之内。2.2 样品处理条件的选择 肉制食品所含成分复杂，目前主要采用有机溶剂液相萃取。尝试采用乙腈、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等溶剂，正己烷效果最好。因肉制食品含有大量油脂，在萃取PAEs过程中油脂易被正己烷同时提取，对样品测试产生干扰。考虑DEP、BBP、DBP、DEHP、DOP的凝固点分别为： -40、-35、-35、-55、-25，而大部分油脂尤其是肉制食品中的主要油脂动物脂肪，在-8以上即发生凝固，故在-10下高速冷冻离心，可除去大部分油脂，减少干扰14。2.3 特异性 图1给出了一系列具有代表性的色谱图。图1(a)是空白肉制食品的色谱图，可见尽管有生物杂质的特征峰，但均不在5种PAEs出峰时间段，,对分析物不产生干扰；图1(b)为5种PAEs的标准谱图，浓度均为10.0g/mL。DEP、BBP、DBP、DEHP、DOP的保留时间分别是4.6050.005、7.9680.005、8.7300.007、20.1660.012和21.0780.007min；图1(c)为加标模拟样的色谱图，在图中5种PAEs的特征峰能够轻易准确地识别；图1(d)为一个出厂3个月的实际肉制食品的色谱图，其中检出有DOP，含量为23.2ng/g。2.4 回归方程及检出限 取1.4所述的标准系列溶液，在选定的色谱条件下，依次进样，记录色谱图，每个浓度重复进样3次。分别以每种物质的平均峰面积(y，mAUmin)对质量浓度(，g/mL)作图，得回归方程及检测限如表2所示。线性相关系数在0.99991.0000之间，表明5种PAEs在0.0110g/mL范围内线性良好。在该条件下，基线噪声为001mAU，以3倍信噪比(S/N)计算检出限，结果如表2。2.5 回收率与精密度 取05g火腿肠3份，各加入10、1、0.1g/mL的混合标准溶液0.1mL，即得添加量分别为1、0.1、0.01g的加标模拟样，按照1.5进行样品处理，每个加标模拟样重复测定5次，计算回收率和精密度，结果如表3所示，5种PAEs的高、中、低3水平的回收率均在79.5%102.0%之间，相对标准偏差均在1.1%14%之间，表明该方法具有较好的回收率与精密度。其中DOP的回收率稍微偏低，原因可能是其凝固点相对较高，在冷冻离心过程中损失相对较大。2.6 样品分析 选取同一厂家、同一批次的肉制食品火腿肠，采用本方法分析，测定5种PAEs含量