基因编辑技术和原理.ppt

什么是基因编辑技术和原理，李傲慢，基因编辑技术？ 基因编辑是定点修饰基因组的新技术。 利用该技术，可以准确定位于基因组的某个部位，在该部位切断目标DNA片段，插入新的基因片段。 这个过程模拟了基因的自然突变，修正和编辑了原基因组，真正达到了“编辑基因”的目的。 基因编辑的研究背景下，传统的动物育种方法受种源的限制，其过程耗费大量人力、物力和财力，需要经历长期的培育过程。 另外，异种间杂交困难，育种成果难以取得突破性进展。 基因编辑原理、现代基因组编辑技术的基本原理相同，通过特异的DNA双链断裂激活细胞自然修复机制，包括非同源端结合和同源重组修复两条途径。 1 .非同源端连接(NHEJ )在低保真度修复过程中，断裂的DNA在修复再连接过程中发生碱基随机插入或丢失，编码变异使基因失活，实现目标基因的剔除。 当外源性供体基因序列存在时，NHEJ机制将其与双链断裂DSB位点连接，实现定点基因敲入。 (位移变异：在正常的DNA分子中，由于碱基缺失或3的倍数增加，在该位置后面的一系列代码中发生位移错误的现象称为位移变异。 2 )同源重组修复(HR )是一个相对忠实的修复过程，当存在具有同源臂的重组供体时，供体中的外源基因通过同源重组过程完全整合到靶位点，不会发生随机插入或丢失碱基。 一个基因两侧同时发生DSB，当存在一个同源供体时，可以进行原基因的置换。 基因编辑原理、基因编辑技术种类目前主要有3种基因编辑技术，分别是人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc-fingernucleases，ZFN )技术转录激活因子样效应核酸酶(transcription activation ) RNA诱导的CRISPR-Cas核酸酶技术(CRISPR-Cas9 )。 1.ZFN基因组编辑技术、ZFN技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是在具有独特DNA序列识别的锌指蛋白的基础上发展起来的。 1986年Diakun等首先在真核生物转录因子家族的DNA结合区发现了Cys2-His2锌指模块，1996年Kim等首次人工结合了锌指蛋白和内核酸酶。 2005年，Urnov等人发现4个锌指连接的ZFN可以识别24bp的特异序列，明确了ZFN在基因组编辑中的应用。 ZFN由锌指蛋白(ZFP )和Fok核酸内切酶组成。 其中，由zpf构成的DNA识别区域识别并结合特异部位，与此相对，由Fok构成的切断区域执行剪切功能，两者的结合切断目标部位的双链DNA (DSB )。 细胞可通过同源重组(HR )修复机制和非同源末端连接(NHEJ )修复机制修复DNA。 HR修复可能对目标部位进行恢复修饰或插入修饰，但NHEJ修复容易发生插入突变或缺失突变。 两者均可引起编码突变，达到基因敲除的目的。 ZFN诱导的基因组编辑技术可应用于多个物种和基因部位，具有良好的发展潜力。 但目前该技术的普及：(1)制约了传统策略中高亲和性的ZFN的设计，需要投入大量工作和时间；(2)继续在细胞中表达ZFN对细胞具有毒性；(3)三联体设计具有特异性，但具有一定的脱靶效果。 2.TALEN基因组编辑技术，2009年，研究人员发现植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas )转录活性子样效因子，其蛋白核酸结合区氨基酸序列与靶区核酸序列有较为一定的对应关系。 随后，TALE特异性地认识到DNA序列的特性，取代了ZFN技术的锌指蛋白。 设计性更强，不受上下游序列的影响，有比ZFN更广泛的应用可能性。TALENs含有两种TALEN蛋白质，TALEN分别融合了TALEarray和foki。 一个TALEN以正义链上的靶部位为靶，另一个以反义链上的靶部位为靶。 foki形成二聚体，靶序列正中间的spacer切断DNA，切断双链DNA后，细胞启动DNA损伤修复机制。 不同TALEN骨架的最佳空格长度不同，其长度范围一般为1220bp。 实验结果表明，TALENs在靶DNA时，第一个碱为t时，其结合效果更好。 目前，TALEN已成功应用于酵母、哺乳动物和植物的部位特异性基因靶点，锌与核酸酶系统相比具有较大的应用优势，但仍需要解决：脱靶效应、TALEN与基因组的特异性结合与染色体位置和邻近序列有关等问题。 3.CRISPR/Cas9基因组编辑技术，1987年，Ishino等在K12大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔的重复序列，随后发现该间隔的重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。 经过数十年的研究，2007年才证实了该重复序列与细菌获得性免疫的关系。 CRISPR/Cas系统由Cas9的内切酶和sgRNA组成。 转录的sgRNA折叠成特定的三维结构后，与Cas9蛋白形成复合体，指导Cas9内核酸酶识别特定的靶点位置，在PAM序列上游切断DNA切断双链DNA，启动DNA损伤修复机制。 从不同菌种分离的CRISPR/Cas系统，CrRNA (或人工构建的sgRNA )靶序列长度不同，PAM序列也可能不同。 在这个系统中，只用RNA就能识别、分解外来基因的功能蛋白质受到研究人员的关注。 截止到2012年，Jinek等人首次在体外系统中发现CRISPR/Cas9是可编辑的短RNA介导的DNA内切酶，CRISPR/Cas9基因组编辑技术成功。 3种不同技术的比较，基因编辑的优势，与传统的基于同源重组和胚