PCR体系优化新PPT课件

.1、荧光PCR体系和多色荧光PCR的优化，程杨戬，厦门大学生命科学院分子诊断实验室，2，3、什么是Ct值和Rn？Ct值中的C表示循环，T表示阈值，Ct值表示当每个反应管中的荧光信号达到设定阈值时经历的循环次数。Rn:相对荧光强度，4、为什么Ct值用于定量而不是终点相对荧光强度。5、实时荧光聚合酶链反应是如何定量的？标准曲线可以用已知起始拷贝数的标准绘制，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值(如图所示)。因此，只要获得未知样品的Ct值，就可以从标准曲线计算出样品的起始拷贝数。在一定范围内，Ct值。6、聚合酶链反应检测过程。7、实时荧光定量PCR优化目标，3、r值，8、优化内容、引物设计、选择探针设计、选择反应体系优化、反应程序优化、丙型肝炎病毒、分子信标、9，引物设计和选择1，序列搜索和比较，10，附件：主数据库网站，11，二级结构分析，条件：42；50毫纳。2.5 mmmg2，/祖克尔姆/核糖核酸/，引物设计和筛选2，12，HCV5UTR，13、引物筛选结果、引物设计和筛选4、14，引物剂量优化，不对称聚合酶链反应(s/a=1: 4)与对称聚合酶链反应(s/a=1: 1)，引物设计和筛选5，15，探针设计和筛选1，探针设计，16，探针设计和筛选2，探针的Tm值，17、探针设计和筛选3、退火温度的确定、18、探针剂量的优化、探针设计和筛选4、19，不同TaqE的比较，Taq1，Taq2，反应系统的优化1，20，优化TAQE的浓度，0.5U/T，1.0U/T，2.0U/T，3.0U/T，优化反应系统2，21，dNTP浓度的优化，反应体系的优化3，Mg2对荧光强度的影响。优化23，Mg2和退火温度-(正方形阵列)。24，聚合酶链反应启动子的作用，比较25，AMV和MLV。26，M-MLV剂量的优化。27，高浓度核糖核酸，低浓度核糖核酸，四个浓度的比较：24U/T12U/T8U/T4U/T，优化核糖核酸酶抑制剂浓度，28，优化前后含量的比较，29，比较反转录时间，反转录时间(30分钟；45分钟；60分钟)，优化反应程序。30，优化逆转录-聚合酶链反应扩增程序，逆转录-聚合酶链反应扩增程序(优化前)，42度，60分钟，95度，3分钟，95度，30秒，55度，20秒，反转录，预变性，延伸，逆转录-聚合酶链反应扩增程序(优化后)，42度，45分钟，95度，3分钟，95度，10秒，58度，45秒，反转录，预变性，50个循环，45个循环，72度，20秒，退火，45个循环31、优化前后对比，优化后对比，优化前对比。32、多色荧光聚合酶链反应、双色荧光聚合酶链反应、三色荧光聚合酶链反应、多色荧光聚合酶链反应、33、多色荧光聚合酶链反应的特点，高效性，在同一个聚合酶链反应反应管中可以同时检测多种病原微生物，或者可以对多种类型的靶基因进行分型，特别是一滴血可以检测多种病原体。(2)系统的多重聚合酶链反应非常适合于检测成组的病原体，如肝炎病毒、肠道致病菌、性传播疾病、无芽孢厌氧菌、战争创伤感染菌和细菌战剂。经济性，可以在同一反应管中同时检测多种病原体。它将大大节省时间、试剂和费用，为临床提供越来越准确的诊断信息。嘿。34，双色荧光聚合酶链反应，FAM，乔，3