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公共选修课：肿瘤治疗药物及早期诊断研究概论第三章肿瘤信号转导通路及相关药物,查晓明手机mail：xmzha,2015年3月1日,1,血管生成与侵袭转移,血管生成（angiogenesis）是肿瘤生长、转移、扩散的一个必要条件,它是在原有血管的基础上,血管内皮细胞以出芽的方式形成血管的过程。,血管生成与侵袭转移,肿瘤转移(metastasis)是一个复杂、多步骤、连续的主动过程,包括以下几个步骤:肿瘤细胞间因黏附能力下降而从原发部位脱落,这是肿瘤转移的开始;肿瘤细胞穿破脉管进入血管或淋巴管;在脉管逃脱血小板及宿主免疫活性细胞的作用而生存;通过与血管或淋巴管内皮和(或)内皮下基底膜作用停留并外渗出脉管,因为内皮基底膜没有足以使肿瘤细胞自然通过的通道,所以肿瘤细胞需借助胶原酶及蛋白水解酶的水解作用破坏基底膜才能穿出管壁;脱离循环系统的肿瘤细胞在其他部位继续生长。,转移是恶性肿瘤最本质的表现。良性肿瘤不转移，只有恶性肿瘤才发生转移。恶性肿瘤中，只有少数肿瘤不发生或很少发生转移，如皮肤的基底细胞癌、脑的恶性胶质细胞瘤。应当指出，浸润是转移的基础。,1.淋巴道转移：,淋巴道转移是癌转移的重要途径，少数肉瘤如滑膜肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤也可发生淋巴道转移。淋巴道转移与淋巴引流的方向相同，但少数情况下也可发生跳跃转移或逆行转移。,瘤细胞侵入淋巴管，随淋巴液进入局部淋巴结，先聚集在边缘窦，逐渐累及破坏整个淋巴结，并可进一步转移到下一站引流淋巴结，最终经胸导管进入体循环。受累的淋巴结肿大、变硬、互相粘连成团，切面灰白而干燥。,2.血道转移：,血道转移是肉瘤转移的重要途径，少数癌如肾细胞癌、肝细胞癌、肺癌以及其它癌的晚期也发生血道转移。肝、肺是两个血道转移的靶器官。,肿瘤侵入血管，随血流运行，到达远隔器官。肿瘤栓子进入门静脉引起肝转移；进入体静脉引起肺转移；进入肺静脉引起全身性转移；进入胸、腰、盆腔静脉，可通过吻合支，进入脊椎静脉丛引起脊椎、脑转移。,3.种植性转移：,体腔内器官的肿瘤累及到器官的表面时，瘤细胞可脱落并种植到体腔各器官的表面，形成种植性转移瘤。腹腔、胸腔最常受累，心包腔、蛛网膜下腔亦可受累。常在浆膜面形成多数转移结节，很少侵入器官的深层，并常伴血性积液，积液内可查到肿瘤细胞。,4.接触转移：,非常罕见。如下唇肿瘤转移到上唇的接触部位。,由此可见血管生成不但能为实体瘤提供养分和氧气,还与肿瘤细胞的转移有关,而肿瘤侵袭性增强也为血管生成创造一定的有利条件。,血管生成与侵袭转移,血管生长因子信号通路许多肽类生长因子以自分泌或旁分泌的方式诱导血管生成,统称为血管生长因子。如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胎盘生长因子(PGF)以及血管生长素(angiogenin)等。其中VEGF在血管发生、病理、生理过程的作用最为重要,其他生长因子虽具有和VEGF相似的活性,但大都通过VEGF发挥作用。,VEGF及其受体,VEGF:VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、PIGF（胎盘生长因子)、orfviralVEGF同系物VEGFR：VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3其中VEGFR2是血管新生和有丝分裂过程主要的VEGF信号转导受体。属于蛋白酪氨酸激酶(PTK)超家族。其结构特点是胞内区具有PTK活性域,当受体与细胞因子结合时,受体的PTK功能可被激活,通过磷酸化下游分子诱导血管内皮细胞增殖。,VEGF诱发的细胞内信号转导,血管生长因子信号通路,相关药物瘤内血管对肿瘤细胞有重要意义，抗血管生成药物研发已成为肿瘤治疗的的热点之一。目前该类药物除单克隆抗体药物如帕尼单抗、贝伐单抗等以外,其余大多是小分子酪氨酸激酶抑制剂。,Lapatinib由葛兰素史克生产。是一种口服的小分子表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂。口服吸收不完全，而且个体差异较大，约4h后达到最大浓度(Cmax)，半衰期24h，每日给药后67d达到稳态。,Lapatinib拉帕替尼是小分子4-苯胺基喹唑啉类受体酪氨酸激酶抑制剂，抑制表皮生长因子受体（ErbB1）和人表皮因子受体2（ErbB2）,Erlotinib可试用于两个或两个以上化疗方案失败的局部晚期或转移的非小细胞肺癌的三线治疗，基于国外一项期临床研究结果得出。,帕唑帕尼(pazopanib)是酪氨酸激酶抑制适应证：帕唑帕尼是一种激酶抑制剂适用于为治疗晚期肾细胞癌患者,血管生成与侵袭转移,肿瘤侵袭转移化疗或放疗对早期肿瘤效果较好,因为此时的肿瘤细胞侵袭能力差,易于被杀死,而中晚期肿瘤复发很大程度上是因为有肿瘤细胞转移至其他组织而产生转移性肿瘤。据估计约有90%的癌症病人死于转移性肿瘤,所以要想最大程度的治愈肿瘤就有必要抑制肿瘤细胞的侵袭转移能力。,肿瘤侵袭转移,肿瘤转移是指肿瘤细胞从原发部位经远程转移至次发部位的复杂的多步骤过程。肿瘤细胞侵袭转移有多种诱因,当瘤内缺氧时,会引起Hypoxia表达,导致与细胞生长、血管生成等相关的信号活化,肿瘤细胞侵袭能力增强;因肿瘤细胞过度生长所产生的机械压力也是诱因之一,压力通过细胞骨架蛋白传至细胞内部,激活特定的基因表达,改变细胞的移动能力。肿瘤细胞完成迁移首先需要获得破坏和重建细胞间及细胞与基质间黏附、破坏基底膜的能力,然后需要提升运动能力,只有这样才能脱离瘤组织束缚,进入循环系统进而侵入其他组织并继续分裂增殖。,肿瘤侵袭转移,肿瘤侵袭转移,细胞内和细胞外的多种细胞因子、蛋白酶、信号转导通路蛋白、受体都参与了肿瘤细胞转移的起始和后继过程,是开发抗肿瘤转移药物的有效靶标。胞内主要是信号通路蛋白与跨膜蛋白,如PI3K/AKT、MAPK、VEGFR等胞外包括细胞因子、黏附分子、蛋白酶等。,糖复合物,肿瘤细胞表面常可见的糖蛋白、糖脂等糖复合物,肿瘤组织内也有大量分泌型的糖蛋白。糖复合物被认为在肿瘤转移过程中介导重要的病理过程,如肿瘤细胞黏附、运动等。肿瘤细胞膜表面糖基化作用的改变可通过调节黏附水平易化侵袭性瘤细胞脱离原发瘤组织,还可利用糖复合物配体与凝集素作用,结合在血小板、免疫细胞上,有利于在循环系统中散播。,糖复合物,硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparansulphateproteoglycans,HSPGs)和趋化因子的结合能促使趋化因子梯度分布形成,易化瘤细胞进、出血管和淋巴管。并且许多肿瘤细胞可产生类肝素酶催化HSPGs的肝素链水解,其产物不但能促进瘤细胞转移,还能促进生长因子释放,因此抑制类肝素酶活性有助于降低肿瘤转移能力。肝磷酯及其衍生物可抑制类肝素酶活性并阻止HSPGs水解产物与生长因子相互作用。,糖复合物,PI-88是酵母细胞膜外硫酸甘露聚糖的衍生物,目前正在进行针对黑色素瘤和多发性骨髓瘤的临床II期试验,同时针对肺癌的临床试验已进行到期;模拟肝素酶底物水解的过渡态得到了相对分子质量较小的抑制剂,抑制活性达mol/L。,细胞黏附分子,细胞黏附分子是参与细胞与细胞之间及细胞与细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)之间相互作用的分子。大致可分为5类:钙黏素(cadherin)家族、选择素(selectin)家族、免疫球蛋白(immunoglobulin)超家族、整合素(integrin)家族及其他(如CD44)。,整合素/FAK信号转导通路,整合素（integrin）大多为亲异性细胞粘附分子，其作用依赖于Ca2+。介导细胞与细胞间的相互作用及细胞与细胞外基质间的相互作用。几乎所有动植物细胞均表达整合素。由（120185kD）和（90110kD）两个亚单位形成的异二聚体。,整合素与膜上受体结合后,与胞内肌动蛋白、骨架蛋白等相互作用,形成肌动蛋白应力纤维的膜下终端,再和许多酪氨酸激酶、丝/苏氨酸激酶作用,最终形成聚焦黏着斑(focaladhesionplaques,FAP)。其中黏着斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)的激活是黏着斑发挥效应的中心,FAK酪氨酸残基磷酸化能通过paxillin、Grb2、Cas、PI3K及STAT等与信号转导有关的分子,激活MAPK等多条信号转导通路。,抑制整合素与受体的结合可阻止黏着斑激酶活化,起到抗肿瘤转移的效果。根据阻断受体的作用机制不同,可分为抗整合素单克隆抗体和能够封闭整合素结合位点的拮抗剂两类,后者包括基于胞外基质蛋白RGD序列的合成多肽和肽类衍生物以及来源于天然生物毒素的解离素。,选择素(selectin）,是一类异亲型结合、Ca2+依赖的细胞粘着分子，能与特异糖基识别并结合。主要参与白细胞与血管内皮细胞之间的识别与粘着。主要有platelet选择素、endothelial选择素、leukocyte选择素。又称选择蛋白，选择凝集素。是细胞黏附分子中的一个家族，为I型单链跨膜糖蛋白。,选择素(selectin）,分子结构(1)N端的钙离子依赖的C型外源凝集素（lectin）结构域，可结合碳水化合物基团，即为选择素的配体结合部位；(2)表皮生长因子(EGF)样结构域，系维持选择素构型所必需；(3)近膜端的多个补体调节蛋白重复序列。,肿瘤细胞需要与血小板、淋巴细胞形成聚合物以逃避免疫细胞的攻击,并需黏附在内皮细胞上才能渗出毛细血管,而选择素与肿瘤细胞膜上过量表达的糖复合物结合正是与血小板、淋巴细胞黏附的关键过程。选择素的配体在翻译后需要进行必要的修饰才能被选择素识别,这些修饰主要是糖基化,少数还需要在糖基化的基础上进行糖链硫酸化修饰。在高尔基体内经由N2乙酰胺基葡萄糖、半乳糖基、唾液酸基和岩藻糖基化等一系列反应完成糖基化修饰,而岩藻糖基转移酶(fucosyl2transferases,FT)所催化的岩藻糖基化是关键的修饰过程,因此催化岩藻糖生成的fucose2generatingFXenzyme也是选择素配体生成的关键酶。,考虑到选择素在肿瘤转移中的重要地位及其调节机制,可以通过以下途径进行调控:应用抗体或重组配体与肿瘤细胞膜表面的配体竞争选择素,从而破坏肿瘤细胞与血小板、淋巴细胞的黏附。模拟岩藻糖基化过程的岩藻糖基供体、受体或酶催化过渡态结构抑制FT。根据配体结构寻找选择素抑制剂,如一种海洋天然产物岩藻糖硫酸软骨素也是P、L2选择素的抑制剂。肝磷酯及低相对分子质量类似物也可作为选择素的抑制剂,但如前所述这类分子同时也具其他作用,可能副作用会比较大。Fucose2generatingFXenzym是选择素配体生成的关键酶,针对其采用和FT抑制剂相似的策略应该也能得到较好的抑制肿瘤转移药物。,蛋白酶,蛋白酶(proteases)种类较多,主要分为3个家族:丝氨酸蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMPs)、半胱氨酸蛋白酶,以各种蛋白为底物。肿瘤细胞的侵袭转移需要借助蛋白酶的水解作用破坏ECM,脱离原发组织,进而分布到其他部位。,MMPs,为基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶是一个大家族，其家族成员具有相似的结构，一般由5个功能不同的结构域组成:（1）疏水信号肽序列;（2）前肽区，主要作用是保持酶原的稳定。当该区域被外源性酶切断后，MMPs酶原被激活;（3）催化活性区，有锌离子结合位点，对酶催化作用的发挥至关重要;（4）富含脯氨酸的铰链区;（5）羧基末端区，与酶的底物特异性有关。其中酶催化活性区和前肽区具有高度保守性。,MMPs作用机制,Rho信号通路,Rho全称Ras同系物(rashomo-logue),是小相对分子质量G蛋白超家族成员。目前已发现包括Rho(RhoA、RhoB、RhoC)、Rac、Cdc42的3个亚家族共22种成员蛋白。Rho蛋白能够与GDP/GTP结合和水解GTP为GTP酶,使其在活性型与失活型之间循环。,Rho信号通路,调节这个循环过程的3类重要蛋白是:鸟苷酸交换因子(guanine-nucleotideexchangingfactors,GEFS),催化GDP的释放和GTP的结合,活化RhoGTP酶。GTP酶活化蛋白(GTPaseactivatingprotein,GAP),作为负向调节因子加速RhoGTP酶的水解,使RhoGTP酶由活性状态变为无活性状态。GDP解离抑制因子(GDPdissociationinhibitor,GDI),阻止GDP从RhoGTP酶上分离,抑制RhoGTP酶活性。,Rho相关抑制剂,开发抑制RhoGTP酶活性的药物可从以下几方面考虑：与Ras蛋白相似,抑制Rho蛋白羧基端可抑制Rho蛋白的活性。抑制鸟苷酸交换因子。直接抑制Rho蛋白,从而使GDP与GTP不能正常交换,或使Rho蛋白与下游靶效应分子不能结合。还可特异性抑制RhoGTP酶的下游靶效应分子ROCK，如ROCK抑制剂Y227632可降低恶性肿瘤细胞的侵袭能力,改变肿瘤细胞侵袭相关性质。,DNA/RNA与染色体调节,DNA是细胞内一切活动的最终调控者,目前学术界对肿瘤发生机制的认识逐渐趋于一致,即因内外环境因素诱导细胞内DNA突变或染色质倍增,细胞中的原癌基因活化,遗传行为异常是肿瘤产生的根源。肿瘤细胞内的染色体、DNA总是异于正常细胞,如染色体状态改变、染色质倍数扩增、基因突变缺失、基因甲基化状态异常等,这些异常现象表现为增殖等相关蛋白的过度表达等,过量的转录因子也以正反馈的方式促进癌基因的转录,加速肿瘤进程。,DNA甲基化调节DNMT(DNAmethyltransferase),转录因子NF-B信号转导通路,染色质调节HDAC通路,A,B,C,Contents,染色质调节HDAC通路,HDAC和HAT的动态调节组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)是一类蛋白酶,对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一般情况下,组蛋白的乙酰化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。HAT为组蛋白乙酰化转移酶。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。,HDAC抑制剂,HDAC的催化区由390个氨基酸残基组成,其活性区域为一个底部较宽的弯曲管状口袋,通过电荷传递移去乙酰基,其中一个重要部分是口袋底部的锌离子结合位点,对该位点的锌离子进行螯合是HDAC抑制剂作用机制中的一个重要因素。,异羟肟酸(hydroxamicacid),异羟肟酸类HDAC抑制剂：由环、脂肪链和异羟肟酸三部分组成,它们分别为表面识别区、连接区和金属结合区(锌结合区)。,异羟肟酸类(hydroxamicacid),在结构上,TSA与SAHA比较相似,但是,TSA对HDAC的抑制活性则要强得多。它们最大的不同在于TSA连接区含有双烯和一个R型甲基。TSA的表面识别区芳胺环能与酶囊氨基酸残基相作用也可能是活性高的关键之一。,将异羟肟酸类化合物的金属结合区分成A和B两部分,然后对A和B分别改造,研究其对活性的贡献,寻找结构优化的方向,以发现活性更强的衍生物,这是异羟肟酸抑制剂的主要研究方向之一。,环状四肽类(cyclictetrapeptide),此类化合物的分子中均含有一个环四肽结构,与HDAC抑制剂药效团模型(表面识别区-连接区-金属结合区)一致,氨基酸大环是疏水的表面识别区,烷链为连接区,金属结合区含功能基团,环肽类HDAC抑制剂作用HDAC酶的方式与异羟肟酸类一致。,短链脂肪酸类(short-chainfattyacid),短链脂肪酸类HDAC抑制剂结构比较简单,主要有丁酸、戊酸和苯丁酸及其盐类化合物。脂肪酸类抑制剂的金属结合区是其羧酸基团29。这类药物的选择性较差,酶抑制活性较低,在体内代谢也较快,生物利用度低,所以需要在较高浓度下给药。,苯甲酰胺类化合物(benzamides),苯甲酰胺类HDAC抑制剂的金属结合区是苯甲酰胺基团,如果氨基被取代,则活性丧失。这类抑制剂通常比对应的异羟肟酸类和环肽类化合物活性低。,HDACinhibitors,DNA甲基化调节DNMT,DNA甲基化调节DNMT,DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNAmethyl-transferase,DNMT)的催化下,在胞嘧啶的5位碳原子引入一个甲基,使之变成52甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。DNMT家族至少包括DNMT1、DN2MT2、DNMT3a和DNMT3b4个成员。DNMT1是最早发现的DNMT,是DNMT家族中最为重要的一员,起着维持甲基化的作用,即根据亲本链上特异的甲基化位点,在DNA半保留复制出的新生链相应的胞嘧啶上进行甲基化修饰的过程。DNMT3亚家族包括DNMT3a和DNMT3b两个成员,它们的功能主要是参与从头甲基化,即在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化,从头甲基化完成后就由维持甲基化来维持其稳定的甲基化状态。,。因此正常甲基化模式的建立需要DNMT3、DNMT1的共同作用,DNMT1是DNMT3启动子CpG岛核苷酸从头甲基化的保证,而DNMT3则使甲基化水平提高到正常需要水平97,98。,DNMT抑制剂,DNMT抑制剂就其作用部位来分,主要有二类:一类是富GC区的DNA嵌入剂一类是直接作用于DNMT的抑制剂,直接作用于DNMT抑制剂,5-氮杂胞苷临床上用于治疗乳腺癌、肠癌、黑色素瘤、急性粒细胞性白血病等有一定疗效。,直接作用于DNMT抑制剂,地西他滨为一种2-脱氧胞苷类似物。地西他滨有抗肿瘤活性，且表现为剂量相差的双重机制。高浓度时具有细胞毒作用，低浓度时具有去甲基化作用。作用于增殖期(S期)细胞。与5-氮杂胞苷一样，此类去甲基化药物在体内外均能通过抑制DNA甲基转移酶使抑癌基因恢复正常的去甲基状态，重新激活那些由于DNA过度甲基化而失活的基因，使细胞恢复正常终末分化、衰老或凋亡。地西他滨抑制DNA甲基化的活性是5-氮杂胞苷的30倍。,新型抑制剂,没食子儿茶素没食子酸酯,普鲁卡因,转录因子NF-B信号转导通路,NF-B及其激活途径NF-B为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位：Rel(cRel)、p65(RelA,NF-B3)、RelB和p50(NF-B1)、p52(NF-B2)。p65、cRel和RelB分含有N端Rel同源区(Relhomologydomain,RHD)和C端的反式激活结构域（transactivationdomain,TD），在RHD的C末端有一个核定位区域(nuclear-localizationsequence,NLS)，负责与DNA结合、二聚体化和和核易位，而TD则与转录活化相关。,NF-B信号通路,最基本的NF-B信号通路，包括受体和受体近端信号衔接蛋白，IB激酶复合物，IB蛋白和NF-B二聚体。当细胞受到各种胞内外刺激后，IB激酶被激活，从而导致IB蛋白磷酸化，泛素化，然后IB蛋白被降解，NF-B二聚体得到释放。然后NF-B二聚体通过各种翻译后的修饰作用而被进一步激活，并转移到细胞核中。在细胞核里，它与目的基因结合，以促进目的基因的转录。,NF-B经典和非经典通路,NF-B的经典信号通路和非经典信号通路的主要区别就在于：在NF-B的经典信号通路中，IB蛋白的降解使NF-B二聚体得到释放。而在NF-B非经典信号通路中，则是通过P100到P52的加工处理，使信号通路激活。,NF-B家族,NF-B家族由P50、P52、P65、c-Rel和RelB五个成员组成。它们分别由NFKB1,NFKB2,RELA,REL和RELB基因进行编码。它们都具有一个N端Rel同源结构域（RHD），负责其与DNA结合以及二聚化。另外,在P65、c-Rel和RelB中，存在着转录激活区域TAD，对基因表达起正向调节的作用。P50和P52不存在转录激活区域，它们的同型二聚体可以抑制转录。,NF-B二聚体的存在方式,NF-B二聚体与IB蛋白结合NF-B二聚体与DNA结合NF-B二聚体结构氨基末端为免疫球蛋白相似区域，对某一种形式的B位点具有选择性。C-末端疏水区域提供NF-B各亚基之间的连接。,一般，NF-B是以二聚体的形式存在的，而它的二聚体又有两种存在方式。,IB蛋白家族,IB蛋白家族包括七个成员：IB、IB、IB、IB、Bcl-3、p100和p105。作用：在细胞质中与NF-B二聚体结合，并对信号应答具有重要作用。IB蛋白的结构特点：存在锚蛋白重复区域（即多个紧密相连的钩状重复序列，每个重复序列含有33个氨基酸）。,IB激酶复合物,IKK/IKK1(CHUK)IKK/IKK2(IKBKB)调节亚基NEMO在特定的NF-B信号