第五课-沉淀法生物工程下游技术

第五章沉淀法,生物分离过程的一般流程,沉淀法的目的：,通过沉淀达到浓缩的目的,从而降低了后续的生产费用和简化了后续的生产工艺；沉淀方法可有选择地沉淀所需成分或有选择地沉淀杂质，起到初步分离的作用；将蛋白质由液态变成固态，避免了蛋白质的降解，提高了其稳定性；,对于小分子生化物质常采用等电点沉淀或形成复盐沉淀。如抗生素生产中，四环素可用等电点或尿素复盐沉淀法，链霉素与苯甲胺缩合形成希夫碱沉淀，并在酸性条件下分解以制得成品。对于大分子生化物质常采用盐析、有机溶剂、等电点及亲和沉淀方法。,沉淀法的应用,沉淀法的分类,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）亲和沉淀法；（4）非离子型聚合物沉淀法；（5）聚电解质沉淀法；（6）复合盐沉淀法等；（7）选择性沉淀法。,蛋白质的溶解特性,在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。蛋白质是两性电解质，因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。,蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域,防止蛋白质凝聚沉淀的屏障,蛋白质周围的水化层（hydrationshell)，蛋白质分子间静电排斥作用。蛋白质水化层的厚度和电位与溶液性质密切相关，如温度、pH值、介电常数和离子强度。,盐析法,当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，随着中性盐离子强度的增加，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。,盐析法原理,（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集（2）破坏水化膜，暴露出疏水区域（3）中和电荷，减少静电斥力,S=-sS蛋白质的溶解度，g/L;I离子强度，I=1/2mizi2mi离子i的摩尔浓度；Zi所带电荷常数，图中截距Ks盐析常数，图中直线斜率,Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系,盐析操作,1）加入固体盐法用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况，工业上常采用这种方法。2）加入饱和溶液法用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况。3）透析平衡法先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性并且缓慢，盐析效果好，故多用于结晶。,盐析作用要强需有较大的溶解度盐溶液密度不高盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济例如：盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂。,盐析用盐的选择,一般的规律为：半径小的高价阴离子的盐析作用较强。例如：阴离子盐析效果：柠檬酸PO43-SO42-CH3COO-Cl-NO3-SCN-阳离子盐析效果：NH4+K+Na+Mg2+阴离子对蛋白质溶解度的影响大于阳离子。,1、盐浓度）盐浓度在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。,影响盐析效果的因素,盐析用盐量的确定-饱和度：,目标蛋白质在盐析沉淀操作之前，所需的中性盐的浓度可通过实验确定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于0.lmgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-60%之间。,分段盐析(fractionalsaltingout),可在较低饱和度下先除去杂蛋白，然后在较高的饱和度下，沉淀目标蛋白质，称为分段盐析。分段盐析时，可选择稀一些的蛋白质溶液，使共沉淀作用减至最低限度。,表1血浆蛋白的分段盐析结果,2、蛋白质种类和浓度组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。不同浓度的同种蛋白质溶液要产生沉淀所要求的临界盐浓度不同。蛋白质浓度大时，用盐少，沉淀作用强，蛋白质溶解损失小。一般常将蛋白质的含量控制在23%为宜。,影响盐析效果的因素,对起始浓度为30g/L的碳氧肌红蛋白溶液，目标蛋白在硫酸铵饱和度为58-65之间沉淀出来；当稀释10倍时，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。,硫酸铵盐析过程目标蛋白的最适饱和度是多少？,上清液蛋白浓度,3、pH值为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目标蛋白的等电点处。在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液pH值，以达到最好的盐析效果。,影响盐析效果的因素,在进行盐折时，必须控制pH图中直线都相互平行,pH值,盐析影响因素：,4、温度的影响在高盐浓度下，大部分蛋白质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，盐析可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4进行。,盐析法特点,成本低，操作简单、安全；在中性温和的环境中，不会引起蛋白质变性；盐析后要透析或超滤去盐；只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。,等电点沉淀法,等电点沉淀：在低离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。,pH=pI,等电点沉淀法注意事项,本法适用于疏水性较强的蛋白质；例如：酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。蛋白质的等电点易受盐离子的影响发生变化；自然界中，蛋白质较易结合阴离子，使等电点向酸侧移动。低离子强度下，pH约等于等电点。,在调节等电点时，要注意防止酶的失活或蛋白变性。一般使用可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。蛋白质在等电点附近盐溶作用明显，必须控制溶液较高的离子强度。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用；,定义：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。优点：1）分辨能力比盐析法高；2）沉淀不用脱盐；3）离心收集较为容易；4）溶剂沸点较低，除去回收方便。缺点：1）容易引起变性失活；2）操作要求在低温下进行；3）有机溶剂易挥发，需有防护。,有机溶剂沉淀法,有机溶剂沉淀法机理,有机溶剂沉淀法原理,A降低溶剂介电常数B破坏水化膜C相反力,表2一些有机溶剂的介电常数,常用的有机溶剂,水溶性要好介电常数要小致变性作用要小毒性要小、挥发性适中容易获取常用的有机溶剂：乙醇、甲醇和丙酮,1、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，有机溶剂要预冷，并缓缓加入伴随不断搅拌，一是防止溶液局部升温，二是为了防止局部过浓引起变性作用和分辨率下降。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力。大多数蛋白质在乙醇-水体系中溶解度随温度降低而减少，低温对提高收率也是有利的。,有机溶剂沉淀法的影响因素,2、pH值：许多蛋白质在等电点附近有较好的沉淀效果。3、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量，降低了样品的回收率；样品太浓，会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.52为好，粘多糖则以12较合适。4、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.010.05mol/L为好，常用的中性盐为氯化钠等。,有机溶剂沉淀法的影响因素,例：调pH4.2上清液胰岛素粗品溶液30%丙酮沉淀（杂蛋白）上清液调pH6.0上清液Zn2+胰岛素锌盐,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究-淀粉酶（米曲霉）菌体+水过滤水抽提清液加乙醇（70%）搅拌-淀粉酶,*pH影响收率酶活6.5pH*适宜的pH5.66.0,*温度影响酶活收率1020T*适宜的温度1020,水溶性非离子型聚合物,机理：与有机溶剂相似，破坏蛋白质的水化膜。常用非离子性聚合物：聚乙二醇（PEG）：是一种水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用来沉淀蛋白质。还有葡聚糖、右旋糖酐硫酸酯等。优缺点：1.可在室温下进行2.沉淀颗粒大，易于收集3.能够稳定蛋白质4.PEG难去除用聚乙二醇等非离子性聚合物一般用来沉淀核酸（如质粒）和酶。,多聚电解质沉淀,机理：架桥与静电，与絮凝剂类似。离子型多糖聚合物，酸性多糖、羧甲基纤维素、海藻酸钠。合成的离子聚合物：聚丙烯酸聚苯乙烯季胺盐聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺,此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基团结合；（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等优点：以上盐类复合物的溶解度很低，极容易沉淀析出。缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件。,成盐类复合物沉淀,）金属离子沉淀,金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位（如羧基、氨基、咪唑基和巯基）起反应造成的。例如Zn2+易与组氨酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。,能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、Fe2+、o2+、Ni2+、u2+、Zn2+、Cd2+;能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+;能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：g2+、Ag2+、Pb2+。,选择性变性沉淀法,选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。,分离核酸,沉淀剂：酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的：使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。例如：在核酸提取液中加入氯仿-戊醇或氯仿-辛醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，用苯酚-水溶液提取核酸，而蛋白质在苯酚层中形成沉淀而被除去。,分离多糖,沉淀剂：CTAB(十六烷基三甲基季铵盐溴化物)CPC（十六烷基氯化吡啶）原理：季铵基团上的阳离子与多糖上的阴离子形成形成季铵络合物，降低离子强度，络合物析出，但当离子强度增加到一定范围时，络合物解离，最后溶解。,沉淀剂：三氯乙酸例如用2.5%三氯乙酸处理胰蛋白酶、抑肽酶或细胞色素c粗提取液，均可除去大量杂蛋白，而对所提取的酶活力没有影响。但使用前，必须对酶的酸碱稳定性有足够了解，使用时一般应注意环境条件温和（如低温段时间）,分离蛋白质,各种沉淀方法应用范围,盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。但单独应用较少，多与其它方法结合使用。非离子聚合物沉淀法：用于分离生物大分子。生成盐类复合物沉淀：多用于小分子物质的沉淀。选择性沉淀：多用于除去某些不耐热的和在一定条件下易变性的杂蛋白。,亲和沉淀affinityprecipitation,原理：是一种将生物专一性识别与沉淀分离相结合的分离纯化技术。可逆性溶解聚合物在溶液中和目标分子专一性结合后，在一定条件下形成可逆性沉淀，从而使目标分子形成沉淀从固相分离出来。,可逆性溶解聚合物（solubleandinsolublepolymers，SIS）,SIS上的功能基团可以直接和蛋白质结合发生亲和沉淀，有时也需要将亲和配基结合在SIS上。在物理条件（如pH值、离子强度、温度等）改变时，待分离的生物分子和SIS发生可逆性沉淀。,SIS的种类,pH值敏感型SIS：聚合物的溶解性与自身所带电荷多少相关，当它的净电荷减少时，自身溶解度降低而沉淀。天然可逆性聚合物：脱乙酰壳聚糖（pH6时可溶）、藻酸盐；合成可逆性聚合物：甲基丙烯酸和甲基丙烯酸甲酯的聚合物（EudragitS-100在4.5pH0.17M时，快速完全沉淀。,发生亲和沉淀的配基,生物专一性配基（如辅酶、蛋白质A、IgG）；非专一性亲和配基（如染料、金属离子）。