真核基因在大肠杆菌中的表达ppt课件

真核基因在大肠杆菌中的表达，瑛春梅华南农业大学兽医学院微生物教室2006-11-30，基因与基因工程基因操作的主要技术原理基因克隆酶学基础基因克隆载体基因的分离与鉴定基因的表达与调节，已阐述内容， 综述真核基因在大肠杆菌表达系统大肠杆菌的表达载体真核基因在大肠杆菌中的表达影响真核基因表达效率的因素，第一节真核基因在大肠杆菌表达系统，1 .大肠杆菌表达系统，基因工程学的重要目标是制备大量纯化的蛋白质产物，因此能够高水平表达异源真核蛋白安全且有多种不同菌株和质粒载体。 许多真核基因已经在大肠杆菌中实现了高效表达。 培养方便，操作简单，成本低廉，容易批量生产，大肠杆菌表达系统优势，真核基因与原核基因的差异：包括编码基因的不连续性、内含子序列，大肠杆菌无法加工切断pre-RNA。 转录信号差异：真核基因转录的mRNA不具有结合细菌核糖体所需的SD序列，细菌的RNA聚合酶无法识别真核启动子。 真核基因mrna 5末端有帽子结构，3末端有poly(A )尾，影响其稳定性和与细菌核糖体结合的能力，阻碍正常的转录和翻译。 真核基因在大肠杆菌中表达有很多障碍，解决办法是将克隆的真核基因插入原核启动子的下游。 从真核细胞中分离完全加工的mRNA，通过逆转录合成cDNA，与合适的载体连接，可以克服内含子问题。 已知蛋白质的氨基酸序列，分子量不太大时，可以化学合成不含内含子序列的寡核苷酸片段。 细菌中能够分解真核蛋白质的蛋白酶可以用突变的方法去除。多数真核基因的蛋白质产物存在翻译后的改变过程：由于磷酸化、糖基化等大肠杆菌无此过程，表达的蛋白质无法正确折叠，由此产生的三级结构通常不溶解，常形成封入体，无活性。 表达的真核蛋白被细菌蛋白酶识别和分解。 真核基因在大肠杆菌中表达有很多障碍，2 .克隆基因正确表达的基本条件，最基本条件：正常转录和翻译转录可能：真核基因在原核启动子下游3末端具有转录终止子的翻译： mRNA分子具有RBS(ribosomebindingsite )的AUG 、另一个重要条件是编码蛋白产物能保持正常的稳定性。 表达蛋白用大肠杆菌蛋白酶降解。 蛋白质三级结构形成的速率与其稳定性有关。 蛋白质三级结构的正确形成需要分子伴侣的参与。 大肠杆菌并非所有外源蛋白都有正确的分子伴侣。 第二节大肠杆菌表达载体、大肠杆菌表达载体的基本结构特征，1 .表达载体的基本成分，启动子：影响外源基因表达水平高水平表达外源基因的必要条件：强启动子启动子显示最低基础转录水平：表达外源蛋白不利于宿主细胞诱导型启动子：可以用简单的方法用廉价的诱导物表达外源基因，如IPTG、温度等。 转印终结器的上游启动子为了抑制下游启动子的转印功能(启动子的阻滞作用)，需要在克隆基因编码区域的3末端连接有效的转印终结器。 转录终止子可提高mRNA分子的稳定性，提高蛋白质产物水平。翻译开始顺序：决定mRNA的翻译开始效率。其保守结构尚未鉴定，只能采取降低mrna 5末端二级结构形成的方法，增加RBS中a、t含量、碱的定点突变等。 增强子：特殊的序列因素可以提高外源基因的表达效率。翻译终止符：终止密码子必须存在。 构建表达载体时，为了阻止核糖体的跳跃现象，通常安装所有三个终止命令(UAA、UGA、UAG )。 大肠杆菌最喜欢的密码子： UAA为四核苷酸UAAU时，终止效率会进一步提高。2.常用大肠杆菌表达载体、lac启动子表达载体、乳糖操纵子结构模型和乳糖存在时，lac操纵子受到lac抑制物的负调节。 培养基缺乏乳糖和其他衍生物时，lac抑制物与操纵单元结合，关闭乳糖操纵子的活动。 在培养基中加入乳糖和其他衍生物(IPTG )后，与抑制物质结合，就不再抑制乳糖操纵子。 因此，我们可以通过添加IPTG诱导来实现外源基因的表达。lac操纵子的控制区、核糖体结合区、RNA聚合酶结合区、阻碍物结合区均位于长203bp的hae片段。 203bp的HaeIII片段含有lac启动子、操纵单元和-半乳糖苷酶的前8位密码子。 将这些片段插入质粒中，可构建含有lac启动子的质粒表达载体。该多拷贝质粒中的操作单元结合大肠杆菌中的lac抑制剂，降解抑制细菌染色体的-半乳糖苷酶基因。 由于含有质粒载体(lac启动子、控制单元)的大肠杆菌可以合成-半乳糖苷酶，菌落在加入X-gal (基质)的琼脂平板上呈蓝色。 该显色反应可用于快速鉴定阳性克隆。trp启动子的表达载体，trp高时，trp低时，o，p，trpR，调节区，结构基因，RNA聚合酶，RNA聚合酶， 色氨酸操作子、色氨酸不是衍生物，而是作为辅助阻碍物结合trp阻碍分子。 被色氨酸激活的trp抑制分子与操作单元结合后，RNA聚合酶失去与trp启动子结合的机会，关闭trp基因的转录。 因此，色氨酸浓度低时，trp基因转录开始。通过将、trp操纵子插入质粒载体，可以构筑含有trp启动子的表达载体。 该载体在转化大肠杆菌后被3-吲哚酸诱导，可有效表达外源基因。 该表达载体的优点：表达蛋白的产量高于lac操纵子表达系统。 PL启动子的表达载体来源于噬菌体，是应用最广泛的大肠杆菌表达载体的启动子之一。 受抑制基因cI编码蛋白的正调控。 cI基因中存在温度敏感突变等位基因cI857。 cI857存在于大肠杆菌的染色体上或相容性质粒分子上。cI抑制蛋白在42下失活，因此大肠杆菌在42下培养时，PL启动子开始转录，另一方面，在28-30下培养时，cI抑制蛋白激活，PL启动子成为抑制状态，转录停止。 利用这一特性，只需简单改变培养温度，即可诱导或关闭PL启动子的活性。 通过将PL启动子克隆到质粒载体，可以构建由PL启动子启动的表达载体。第三节真核基因在大肠杆菌中的表达，1 .外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位，在细胞质中的表达：容易形成封入体：由不溶性蛋白质的凝集折叠形成，是外源基因高效表达常发生的特殊生理现象。 封入体形成的理化参数：对80种E.coli80蛋白质进行了研究。 电荷的平均数、形成角氨基酸残基的成分、半胱氨酸的成分、脯氨酸的成分、亲水性和氨基酸残基的总数。通过分析蛋白质的氨基酸成分，可以预测形成封入体的概率。 每个氨基酸在各种二次结构中出现的倾向和频率不同。例如，Glu (谷aa )主要呈螺旋状出现的Asp (天门冬氨酸aa )和Gly (甘aa )主要分布在角落的Pro也多出现在角落，但一般不呈螺旋状出现。、表达蛋白质形成封入体的优缺点：蛋白质容易受到保护，使细胞内酶的分解蛋白质不变为活性的缺点：生物活性蛋白质的最终产量低，解决方法：限制封入体的形成；外源基因和分子伴侣将分子伴侣使用硫代氧化亚丁缺陷寄主菌株的目的：维持有利的氧化还原电位；低温诱导，降低蛋白质合成速度；与高可溶性多肽的融合表达，周质中表达的优点：周质中细胞蛋白质少，有利于外源蛋白质的纯化。 周质中的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠。 周质中蛋白质的分解作用很小。 条件：需要信号肽的诱导，将表达蛋白从细胞内膜周向转运。 信号肽：有原核信号肽，也有真核信号肽。蛋白质转运过程相当复杂的蛋白质跨膜过程与细胞的结构特征有关。 即使存在信号肽，也不能保证蛋白质能正确地周向转运。 例如免疫球蛋白类似于t细胞受体的分子结构。 免疫球蛋白可以周质表达。 t细胞受体在周质上不能表达。胞外表达：容易分离纯化，但相当困难。 原因：细菌细胞有内膜和外膜两层膜，表达蛋白必须跨越两层膜的屏障。 解决方法：利用大肠杆菌固有途径：将外源蛋白与E.coli分泌型蛋白融合表达。 增加E.coli细胞外膜的渗漏性：与信号肽序列、渗透剂、细菌释放蛋白或具有渗透作用的基因共表达。2.融合蛋白的表达，融合基因的概念：来源于两个以上不同基因的具有核苷酸序列的新基因。 DNA体外重组的融合基因：外源基因与启动子的融合：编码产物不一定是融合蛋白质。 由两个以上不同基因的编码序列组成的融合基因：编码产物为单一多肽序列，称为融合蛋白、杂交蛋白、嵌合蛋白。蛋白质融合配体的作用：限制蛋白酶酶解抑制封入体形成改善蛋白质折叠性能，简化蛋白质检测和纯化工艺的种类： GST、His6、MBP等表达融合蛋白质的策略在融合载体中表达融合蛋白质：设计、BamHI、SmaI、EcoRI、XbaI、NcoI、SalIXhoI、SacI、HindIII.融合载体组合表达融合蛋白：克隆外源基因时不考虑码盒问题。 在、pBR322质粒载体中表达的融合蛋白pBR322质粒载体中所含的唯一PstI部位与末端脱氧核苷酸转移酶在dGTP或dCTP中进行同量体的拖尾。 g、c对、T4DNA连接酶连接后，必定有一部分具有正确的读码器结构。融合蛋白的精制：利用与融合蛋白中配体相对应的配体作为吸附剂，制备亲和色谱。 由于配体与配体的相互作用，过柱的融合蛋白质滞留，其他蛋白质流出柱外。 洗脱处理可以回收精制的融合蛋白质。融合蛋白的断裂：配偶体的存在可能影响融合蛋白的功能。 方法化学切断：如溴氰特异性切断甲硫氨酸残基，AUG非起始密码时编码，适用于链内不含甲硫氨酸残基的多肽的切断。 酶切：如凝血因子Xa，在融合基因之间插入编码Xa的识别序列，纯化融合蛋白后，用Xa切除大肠杆菌多肽，获得天然靶蛋白。 3 .外源蛋白质在大肠杆菌中的稳定性、影响因素：蛋白质酶解作用：细菌细胞蛋白酶选择性酶解异常蛋白质，含外源蛋白质。解决方案：外源蛋白在周质或细胞外低温培养使用蛋白酶缺陷的菌株，与分子伴侣一起去除蛋白酶切位点、靶蛋白的疏水性修饰，结构决定因子： N-氨基酸的性质和内部PEST序列的N-末端规则： N-末端为精aa、赖aa、亮aa、苯aa、酪蛋白aa、色aa时蛋白质的n末端附近的内部赖aa是依赖于蛋白质的受体，容易被依赖于蛋白质的蛋白酶分解。 PEST序列指真核蛋白中蛋白质aa、谷aa、丝aa、苏aa丰富的区域，易发生细胞内分解，该序列的磷酸化作用与钙离子结合，促进依赖钙离子的蛋白酶分解。表达部位：周质和细胞外含有的蛋白酶较少，在这些部位表达的蛋白质难以分解。 分子伴侣的稳定作用：阻止聚合作用，促进蛋白质的正确折叠。 某些分子伴侣的过度表达不能正确折叠蛋白质，不同类型的分子伴侣参与蛋白质折叠。影响第四节真核基因表达效率的因素、影响因素：启动子强度、DNA转录开始序列密码子选择、mRNA二级结构转录结束、质粒拷贝数及稳定宿主细胞生理特征等1.5UTR对克隆基因表达效率的影响、启动子结构的影响：启动子结构启动子序列越近，表达能力越强。 -35区与-10区距离：也是影响克隆基因表达效率的重要因素。 距离越接近17bp，启动子的活性越强。 在一些启动子中，-35区上游的10-100bp序列：起到上游活化物质的作用。启动子与克隆基因之间距离的影响：2-3nt长度的变化对翻译效率有显着影响。 与质粒mRNA 5末端的二级结构有关： SD序列和AUG密码子参与mRNA分子的碱基对会显着降低mrna的翻译效率。 为了获得良好的表达，AUG命令或SD阵列必须是易于接触的部位，以便结合核糖体开始翻译过程。 mrna 5末端与SD序列的距离也是影响翻译效率的重要因素，距离不足15nt时翻译效率明显下降。 提高克隆基因表达效率的方案：制备克隆库：将目标基因置于与启动子不同的距离，从重组体中筛选出产量最高的克隆。 对于难以测定表达产物的基因，可以首先将其n端片段与报告基因融合，构建克隆库，报告基因产物的活性，筛选出克隆基因能够有效表达的重组菌落。 最后，将该质粒中的报告基因置换为克隆基因的c末端片段，可以得到高效表达克隆基因的重组质粒。质粒拷贝数的影响：提高表达效率的途径：增加mRNA的数量。 影响mRNA合成速率的因素有启动子强度和基因拷贝数两种。 提高基因拷贝数：克隆到高拷贝数质粒载体。 质粒不稳定性的影响：发生质粒丢失保留抗生素的选择压力将质粒的分配功能区par克隆到质粒载体，2 .质粒的生物学特性对表达效率的影响，反选无质粒细胞。、3.mRNA转录物的分子特性对表达效率的影响，转录开始序列的影响： SD序列的影响：开始密码子上游的5-10nt，核糖体的结合部位。 与16SrRNA的互补度越高，翻译效率越高。 SD序列后4个碱基的影响： 4A或4T的翻译效率最高，4C或4G的翻译效率只有50%或25%。 起始密码子AUG上游三联密码子组成的影响： UAU或CUU时翻译最有效，UUC、UCA、AGG时效率降低了20%。 AUG下游密码子碱组成的影响：例如IFN-第4密码子的第3位碱发生变化时，表达水平会变化30倍。mRNA稳定性的影响： mRNA分子的相对寿命、对RNA酶的抵抗力。