液相色谱—质谱联用的原理及应用最新版本

，液相色谱-质谱的原理和应用，中心实验室，介绍，色谱质谱的在线结合，结合色谱的分离能力和质谱的定性功能，对复杂混合物进行更精确的定量和定性分析。简化了样品预处理过程，简化了样品分析。色谱-质谱包括气相色谱-质谱(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)，液相色谱-质谱分析不同性质的化合物，并相互补充。液相色谱-质谱和GC-MS是第一个适用于小分子、挥发性、热稳定性、气化化合物分析的商用联合仪器。通过电子冲击(EI)获得的光谱可以与标准光谱库相比较。液相色谱(LC-MS)主要可以解决以下问题：非挥发性化合物的分析和测定；极性化合物的分析和测定；热不稳定化合物的分析和测定；大分子化合物(包括蛋白质、多肽、聚合聚合物等)的分析和测定；商品化的频谱库可以不比较查询而直接构建，也可以只使用自分析频谱。随着现代有机及生物质谱的进展，在20世纪80年代和90年代，质谱经历了两次飞跃。到那时，质谱只测定了普通分子量在500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸(FD)电离技术，可以测定分子量在1500到2000Da之间的非挥发性化合物，但重复性很低。能分析分子量达数千个多肽的高速原子质谱(FAB-MS)在20世纪80年代初发明。随着生命科学的发展，要分析的样品更复杂，分子量范围更大，因此产生了电喷雾电离质谱(ESI-MS)和矩阵辅助激光解吸电离质谱(MALDI-MS)。目前有机质谱和生物质量分析器、GC-MS EI和CI源以外的大气压电离(API)(包括大气压雾化电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电电离APPI)和矩阵辅助激光解吸电离。电子通常使用偶极子或离子阱质量分析器统称为API-MS。后者通常使用飞行时间作为质谱仪，配置的仪器称为矩阵辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)。API-MS具有液体色谱、毛细管电泳等功能，可扩展应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学和有机化学的应用。MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加剂的耐受性高，样品测定速度快，操作简单。质谱介绍：质谱是首先电离物质，分离离子的质量-电荷比，然后测量各种离子峰的强度，达到分析目的的分析方法。探测器检测到的离子信号的强度以纵坐标表示，离子电荷比的条形图就是我们一般的质谱图。常用术语：相对原子量单位：离子质量与其携带的电荷(电子电功率单位)之比，m/Z-峰值：质谱中的离子信号一般称为离子峰或简单峰。离子丰度：探测器检测到的离子信号强度。基准峰值：在质谱中指定的质量负荷范围内最大的离子峰值为基准峰值。叫做总离子流。质量色谱；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子，总离子流图：指定在选定质量范围内所有离子强度的总和时间或扫描次数的图，TIC图，质量色谱，指定特定质量(或质量-电荷比)的离子强度对时间的图。利用质量色谱测定特性离子，是复合混合物分析和微量分析中LC/MS测定的最有用方法。样品浓度低的情况下，在LC/MS的TIC中通常看不到峰，此时根据获得的分子量信息输入诸如M 1或M 23的数值，观察提取离子的质量色谱，确定直接注入的信息是否反映在LC/MS中，确定LC条件是否合适，以后进行其他扫描方法(如MRM)的测量时，可以用作参考。，质量色谱，总离子流图，准分子离子：是指与分子有简单关系的离子，可以通过它确定分子量。液晶中最常见的准分子离子峰是M H或M-H-。在ESI中产生质量大于分子量的离子的情况很多，例如，M 1，M 23，M 39，M 18，称为准分子离子，显示为：M H。M Na等，碎片离子：准分子离子通过一次以上分解产生的产物离子。碎片峰的数量及其丰富性与分子结构有关，意味着该分子更容易破碎，古风的碎片峰意味着该离子更稳定，分子更容易破碎，产生该离子。Ephedrine、MW=165、多电荷离子：蛋白质或多肽等离子体。在有机质谱中很常见，单电荷离子绝对多数，形成多电荷离子，例如不易碎的基团或分子结构-共轭体系结构。其存在表明样品比较稳定。用电喷雾的电离技术可以产生很多带电荷的离子，最终通过计算机自动转换成单个/电荷-离子。同位素离子，由元素的重同位素组成的离子称为同位素离子。各种元素的同位素基本上根据自然的丰度比出现在质谱中，这对于利用质谱确定化合物和碎片的元素组成非常方便，将：氘等标记化合物合成为稳定同位素，并通过质谱检测其化合物。这只是质量数的位移，描述化合物结构、反应过程等，看质量分析图的方法：(1)决定分子离子，即决定分子离子，即包含氮原子的分子，其质量为偶数，具有奇数个氮原子的分子的质量为奇数。如果高质量的片段离子和合理的质量不良，质量在3-8和10-13，21-25之间不可能的话，就是片段或杂质。(2)确定元素的组成，即分子表达式或碎片化学表达式，高分辨率质谱由直接从分子量计算化合物的元素组成，分子低分辨率质谱利用元素的同位素丰富度。例：(3)峰强度和结构的关系，丰富度是离子结构在元素周期表的自上而下稳定，从右到左越不杂交，容易持有正电荷，有粉碎的地方容易断裂，这与有机化学基本一致，在分子最弱的地方总是破坏。有机物的种类不同，分解方法也不同。相同类型的有机物具有相同的分解方法，但对质量数的差异需要经验记忆。质谱的一般阶段，(如果低分辨率小分子光谱已经用高分辨率质谱更好地构成元素)，(1)验证得到的光谱，排除本底等因素造成的失真，工作条件适当，(2)熔点、沸点、溶解度等物理和化学特性，样品来源、光谱、光谱数据(4)可能结构所有权的假设和排列：质量离子表示的热分解时丢失的中性碎片(例如M-1、M-15、M-18、M-20、M-31)为h、CH3、M-31.(5)假设与已知参考光谱形成对比的分子结构，或采用类似化合物，并比较质谱。有机质谱的特点，优点：(1)分子量正确，其他技术无法比较。(2)灵敏度，一般10-7-10-8g，单离子检测最高10-12g。(3)快速，几分钟，甚至几秒钟。(4)混合物分析容易，LC/MS、MS/MS对难分离的混合物特别有效，其他技术无能。(5)广泛用于各种化合物的多功能。极限：(1)异构体，立体化学能力差。(2)重复性稍差，必须严格控制运行条件。所以不能像那场NMR，IR等那样直接做，必须专门操作。(3)离子源引起的记忆效果、污染等问题。(4)价格有点贵，操作有点复杂。，质量分析器：质量分析器：质量分析器由以下几部分组成的数据和电源系统组成：/；注入系统离子源质量分析器检测接收器；因此，质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特性，我们可以通过液体-质量耦合软电离方法得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。由机械真空泵(前端极低的真空泵)、扩散泵或分子泵(高的真空泵)组成，它们提取离子源和分析器部分的真空。离子只能在足够高的真空中从离子源到达接收器，真空度不足，灵敏度低。注入系统、将分析样品导入离子源的设备包括直接注入、GC、LC和接口、加热注入、参考注入等。离子源，将被分析样品的原子或分子分离为带电粒子(离子)的装置，加速离子进入分析器，根据电离方法，有机质谱常用的几种类型，其中EI，ESI是最常用的。电子轰击离子化(ei):电子轰击电离-硬电离。化学转化(CI):化学电离-核心是质子转移。现场说明(FD):现场解吸当前默认情况下替换为FAB。fastatombombardment :快速原子轰击-或铯离子(LSIMS，液体二次离子质谱)。静电纺丝(ESI):电喷雾电离-最平滑的电离方法。蛋白质分子多肽等小分子和大分子原子表征(apci):适合分析大气压化学电离的极性分子分析-ibid等弱极性小分子。Appi(气相演示):大气压力喷雾离子化-更适用于非极性分子。maldi(matrixassistedlaserdescription):矩阵辅助激光解吸电离。一般适合飞行时间质谱和FT-MS，尤其是蛋白质、多肽等分子，其中ESI、APCI、APPI统称大气压力电离(API)、实验室现有离子源：ESI电喷雾离子化源APCI大气压力化学离子化源，电子能谱(ESI)的特征，通常是小分子产生m h、M Na或M-H-生物大分子产生多电荷离子的单电荷离子由质谱仪测量质量/电荷比率，因此质量范围仅由数千质量的质谱仪测量数十万质量的生物电喷雾电离是最柔软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可以直接测量混合物，测量热不稳定极性化合物；多电荷离子的特性，易于分析蛋白质和DNA等生物大分子；化合物的结构是通过调节离子源电压控制离子的碎裂(源内部CID)来决定的。大气压化学电离(APCI)的特征大气压化学电离也只产生单电荷峰，适用于测量质量小于2000Da的弱极性小分子化合物。适应高流量梯度洗脱/高/低水溶液变化的流动相；调整离子源电压，控制离子分裂。电喷雾与大气压力化学电离的比较，电离机制：电喷雾利用离子蒸发，而APCI电离是在高压放电中发生质子转移，产生m h或M-H-离子。范例流速：APCI来源可以从0.2到2ml/min。电喷雾源是相对较小的流，通常为0.2-1ml/min。允许中断程度。APCI源探针在高温下足以分解热中不稳定的化合物。敏感度：一般认为，电喷雾有助于分析极性大的小分子和生物大分子以及其他分子量大的化合物，APCI更适合分析极性小的化合物。多电荷：APCI源不能产生一系列多电荷离子。纳米布离子源特别适用于制作流速范围从5nL/min到luL/min的微量生化样品。可以用一滴样本做几个小时的分析。您可以从最小样品消耗中获得最大灵敏度。灵敏度可以到fmole。可直接与微孔HPLC结合。，正负离子模式：ESI和APCI接口都有正负离子测量模式。根据样品的特性选择，还可以同时执行两种模式。质量分析器：是质量分析器中以质量电荷比率分离离子的部分，离子通过分析器分离成不同的质量电荷比率(M/Z)，集中相同的M/Z离子构成质谱。质谱分类：双焦扇区磁场-电场系列测量仪。四极质谱计(q)。飞行时间质谱计。离子阱质谱(TRAP)傅里叶变换-离子回旋共振质谱(ft-ICR ms)。四极TOF(Q-TOF)串行多级质量分析器或三极qqq(qqq)(MS/MS)TOF，执行ms/ms的仪器在原理上可分为两类，第一类是前面列出的串行多级质谱仪，它可以使用质谱仪存在于空间中。第二类使用质量分析器的时间顺序上的离子储存力，该分析器由离子回旋(ICR)和离子阱质量分析器等存储离子的分析器组成。但是不能进行莫离子扫描或中性损失。实验室现有质量分析器类型：系列四极质量分析器(MS/MS):三极(QqQ)离子源第一个分析器碰撞室第二个分析器接收器ms1ms2q1q2q3，qqqqqqq设备可以轻松改变离子的动能，扫描速度快，体积小，经常进入普通实验室作为台式机。缺点是质量范围和分辨率有限，不能进行高分辨率测量，只能进行单位质量分解。通过流星分解能得到化合物的化学式，液相线中使用的碎片化手段将能量以碰撞的形式传递给分子离子，这种能量的亚稳定分子中的特定化学键破裂，部分特定分子足以引起结构重排。碰撞诱导离解CID质谱：选择特定质量的离子作为母体离子，在碰撞室中填充靶反应气体(碰撞气体：N2，He，Ar，Xe，CH4等)，产生离子分子碰撞反应，产生“子离子”，影响cid质谱的因素：所用碰撞气体的种类、压力、离子的能量、仪器的组成和离子电荷状态不能在不同的仪器中对样品进行准确的相同条件下分析，因此，所给化合物在不同的条件下存在差异或提出了较小的质谱。特别是各离子峰的相对丰度差异几乎是不可避免的。因此，目前很难创建供搜索使用的商业化频谱库，只能进行手动分析或自行构建。大气压力电离技术中产生的离子是偶电子离子，主要碎片必须由化学键的诱导破坏和重排反应产生，因此，EI质谱中概述的偶电子离子的裂纹规则一般可以应用于CID质谱的解释。检测接收器：电子倍增器，光电倍增器，微通道板，数据和电源系统提供接收电信号放大、处理和分析结果，并接收控制质