实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件

2013-11-26，实时荧光定量PCR技术的原理和应用(realtimequantitativenr)，1，contents，实时荧光定量PCR目录，2，实时荧光定量PCR的定义，常规一般PCR: 1，终点定量重复性差2，克服了EB毒性、荧光太贵等缺点；实时荧光定量PCR的定义；4，PCR技术与荧光检测技术相结合，通过荧光染料或荧光标记特定探针实时跟踪PCR产品的标记、在线监视反应过程，通过仪器和相应的软件分析结果测量样品的初始模板，实时荧光定量PCR的定义？为什么用初始模板定量代替最终产品定量，5，RT-PCR技术原理和测试过程，6，RT-PCR技术原理和测试过程，7，荧光染料SYBRGreenI，荧光标记探针TaqMan探针方法，RT-PCR技术原理和测试过程，以及AQ)病原体检测转基因食品检测基因表达研究相对定量(RQ)基因表达差异药物疗效评价耐药性研究，RT-PCR技术数据分析，14，相对定量分析内部标准定量，内部标准定量结果包括样品中细胞或基因组的数量，RT-PCR技术数据分析，内部标准，RT-PCR技术数据分析-CT，PCR放大循环数，相对荧光量(背景荧光除外)，1 .荧光域值(threshold)在定量PCR中设置，为了检测荧光信号，需要经过多个周期，通常使用15个周期的荧光信号作为荧光背景信号。17、如何量化？RT-PCR技术的数据分析-CT，PCR放大循环数，相对荧光量减去背景荧光，2 .Ct值的定义在荧光定量PCR技术中具有非常重要的概念Ct值。c表示循环，t表示阈值，Ct值表示在每个反应管内荧光信号达到设置的域值时经过的循环数(参见图)。18、如何量化？分析RT-PCR技术的数据-Ct，3。根据Ct值与起始模板之间关系的研究，每个模板的CT值与该模板起始副本数的日志具有线性关系，起始副本数越多，CT值越小。使用被称为起始副本数的标准，水平坐标可以创建表示起始副本数代数、纵坐标代Ct值的标准曲线。因此，当获得未知采样的Ct值时，将在标准曲线上计算该采样的起始副本数。PCR放大循环数，减去背景荧光的相对荧光量，19，RT-PCR技术的数据分析，3。根据对Ct值与起始模板之间关系的研究，每个模板的Ct值与该模板起始副本数的日志具有线性关系，起始副本数越多，Ct值越小。使用被称为起始副本数的标准，水平坐标可以创建表示起始副本数代数、纵坐标代Ct值的标准曲线。因此，当获得未知采样的Ct值时，将在标准曲线上计算该采样的起始副本数。，20，RT-PCR技术数据分析，21，相对定量分析方法-CT，目标和内部参数序列的放大效率接近100%，偏差在5%以内时为1，目标基因的CT值减去内部参数的CT值： CT (test) 测试样品的 CT值减少校正样品的 CT值：CT=CT(test/control)-CT(calibrator)3，计算表达式水平比：相对表达式rq=2CT，和肿瘤标志物和肿瘤基因检测实现肿瘤疾病诊断；遗传基因检测实现遗传疾病诊断。动物疾病检测：禽流感、猪瘟、沙门氏菌、大肠杆菌、胸膜肺炎、寄生虫病等。食品安全：食品来源微生物、食品过敏原、转基因、乳品企业汉字键Enterobacter等检查。科学研究：医学、农牧、生物