SSR分析的原理及操作技术

SSR分析的原理和操作技术，DNA分子标记技术的类型， 基于南方杂交的分子标记技术：限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)基于聚合酶链反应的分子标记技术：随机引物聚合酶链反应标记和特异性引物聚合酶链反应标记随机扩增多态性DNA(RAPD)-扩增限制性内切酶片段长度多态性(AFLP)-相关序列扩增多态性(SRAP)-简单序列重复(SSR)或简单序列长度多态性(SLP) (SSLP)基于分子标记技术：差异显示(DD)逆转录聚合酶链反应(RT-聚合酶链反应)基于单核苷酸多态性的分子标记技术：单核苷酸多态性(SNP)，简单序列重复介绍，有很多重复根据重复序列在基因组中的分布形式，可分为：串联重复序列(串联重复序列)和间隔重复序列(间隔重复序列)。根据重复基序的长度、拷贝数和位置，串联重复序列进一步分为：卫星DNA:基序(motif)长10-300 bp，甚至1000-100000 BP；很长；小卫星DNA:基序长度为10 60bp微卫星DNA:基序长度为1 6bp，其功能包括重组热点、基因调控和表达以及性别决定。微卫星是一类以几个核苷酸(主要是2-4个)为基本单位的重复串联重复序列，其长度通常很短，大多在200bp以内。微卫星在植物基因组中非常丰富，并且均匀分布在整个植物基因组中。然而，不同植物的微卫星频率差异很大，但(AT)n最大。SSR标记的基本原理，虽然微卫星DNA分布在整个基因组的不同位置，但特定微卫星两端的侧翼序列通常是保守性很强的单个序列。克隆两侧的重复序列和DNA片段并测序，然后根据两端的侧翼序列设计一对特异性引物，通过聚合酶链反应技术扩增目标微卫星DNA片段。SSR标记的基本原理是，由于单个微卫星位点的重复单元数量不同，扩增产物的长度会发生变化，即产生长度多态性，这被称为简单序列长度多态性(SSLP)，每个扩增位点代表该位点的一对等位基因。SSR标记的多态性主要取决于生物群体中丰富的基本单位重复频率的变化。因此，SSR具有大量的等位基因差异，多态性非常丰富。聚合酶链式反应(聚合酶链反应)是一种利用单链寡核苷酸引物在体外快速扩增特定核酸片段的方法。第一个特征是特定的DNA片段被快速大规模扩增，理论上最高值达到2n-2。特征2:它可以指导特定DNA片段的合成。怎么做？聚合酶链反应系统，一对特异性引物：1。引物长度：典型的引物长度是18-24bp，引物需要足够长以确保序列的唯一性。然而，引物长度超过24bp并不意味着特异性更高。较长的序列可能与错配的序列杂交，降低特异性，比短序列慢，从而降低产量。2.引物浓度：一般为0.1-0.5摩尔/升，过高的引物浓度会加剧错配的发生，降低特异性；3.合理水灰比：一般为40% 60%。聚合酶链反应系统Mg2溶液：其浓度直接影响引物退火的特异性、产物特异性、酶的催化能力和准确性等。适当降低Mg2浓度可以提高特异性。模板DNA:一般为1微克/1L，如果模板浓度过高，反应的非特异性会增加；DNTP:一般浓度为50-200 mol/l，dNTP的浓度应该相等，浓度过高容易导致错碱掺入，浓度过低会降低反应收率。Taq酶：DNA聚合酶，耐热，最适温度为72，反应特异性随酶量的增加而降低；酶太少会影响反应产率。10缓冲液(无Mg2+):保持聚合酶链反应ph值的稳定性聚合酶链反应循环条件，高温变性：通过加热将双链DNA模板变性为单链；低温退火：引物和单链DNA在低温下互补配对；不同引物的退火温度差异很大，退火温度过低，容易形成非特异性扩增，而退火温度过高，难以扩增条带。对于长度为20bp、气相色谱含量为50%的典型引物，55是合适的退火温度。适当的温度延伸：TaqDNA酶催化的引物在适当的温度下沿着模板DNA延伸。PCR条件优化，引物设计优化：这是最关键的，可以用计算机来辅助引物设计。热启动技术：当温度升高并超过模板的Tm值(80)后，在第一轮聚合酶链反应中加入关键试剂如TaqDNA聚合酶。这种操作可以减少非特异性扩增。为增加特异性扩增创造有利条件，如降低Mg2+、dNTP浓度、优化酸碱度和降低Taq酶用量、减少循环各部分的时间或循环次数、提高退火温度等。电泳原理，在生理条件下，糖-磷酸骨架中的磷酸基团被核酸分子离子化。当核酸分子被置于电场中时，它们向正电极迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子比分子量较大的DNA分子具有更紧密的构型，因此它们的电泳迁移率更快。电泳介质、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶的优点：分辨率高，能分离长度差仅为0.1%的DNA分子，即1000bp中相差1bp；(2)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度高，可用于最苛刻的实验。聚丙烯酰胺凝胶，聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体组成，在催化剂TEMED(N，N，N，N四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下，聚合形成线性长链，在共聚反应中有交联剂如N，N-亚甲基双丙烯酰胺的参与，聚丙烯酰胺的链被交联形成具有三维带状网络结构的凝胶。这些网孔的平均直径取决于丙烯酰胺和双官能交联剂的浓度。聚丙烯酰胺凝胶和改性聚丙烯酰胺凝胶用于单链DNA片段的分离和纯化。这些凝胶在抑制核酸碱基配对的试剂(如尿素或甲酰胺)存在下聚合。变性DNA在这些凝胶中的流动性几乎完全独立于其碱基组成和序列。非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链DNA片段的分离和纯化。双链DNA在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率通常与其大小的普通对数成反比。然而，电泳迁移率也受其碱基组成和序列的影响，因此两个大小完全相同的DNA的迁移率可以相差10%。非变性聚丙烯酰胺凝胶主要用于制备高纯度的核酸片段和检测蛋白质-核酸复合物。用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物时，聚合酶链反应产物对变性聚丙烯酰胺凝胶的分离效果通常优于非变性凝胶。因为杂合子个体在聚合酶链反应的后期会在循环中产生异源双链分子，导致3条甚至4条条带，而不是正常的2条。这种情况的出现会干扰等位基因的统计。溴化乙锭(EB)染色法：然而，聚丙烯酰胺可以猝灭溴化乙锭(一种荧光燃料)的荧光。电子束染色法很难检测出小于10ng的DNA条带。银染法(硝酸银):是一种理想的检测微量DNA的方法。优点：经济、简单、快速、灵敏、无污染、高分辨率、结果永久保存的原则：银染色液中的银离子(银)能与脱氧核糖核酸形成稳定的络合物，然后在碱性条件下用还原剂如甲醛将银还原成银颗粒，脱氧核糖核酸电泳带能被染成黑褐色，负载缓冲剂、指示剂(溴酚蓝或二甲苯氰)和蔗糖、甘油或多糖400等。热内2.形成可见的指示带来预测核酸电泳的速度和位置。3.给样品上色，使样品添加操作更加方便。1.马奎尔李(母本)蛟河三月红(父本)F1杂种群体部分个体的基因组DNA溶液。每个人制作4个模板。一对特异性引物：B-F09F:5TCTGCTTACAGAGGATGA 3B-F09R:5CTGTGTGTCTGCAGGGTTG 3，2。制备SSR扩增反应溶液：各组分的用量和最终浓度如下表所示。对于多个反应，所用的相同组分可以取样一次，均匀混合，然后分装到每个反应中。3。反应液配制后，放入聚合酶链反应仪中进行扩增反应。扩增程序为：943分钟(预变性)；9450s5550s7250s(35个循环)；在72下反应10分钟(延伸反应)，4。制备5%变性聚丙烯酰胺凝胶：将长玻璃片和短玻璃片固定在橡胶板上，用1.0%琼脂糖密封，小心地将制备好的胶液沿玻璃片的取样点倒入，去除气泡，灌满胶后插入梳子，静置1小时，使其聚合固化。电泳样品的制备：向聚合酶链反应产物中加入8L装载缓冲液，混合得到