DNA的复制PPT课件

.,1,第三章DNA的复制,第一节半保留复制的验证半保留模型（semiconservativemodel）全保留复制模型(conservativemodel)分散模型(Dispersivemodel)。,.,2,.,3,验证半保留复制的实验,一、Meselson-Stahl实验二、Taylar实验,.,4,.,5,图11-4Taylor蚕豆根尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。,.,6,第二节复制原点、方向和方式,一.复制原点定义DNA分子上复制开始的特定位置叫复制原点。常用ori或o表示。E.Coli的复制原点位于ilv基因附近，是约245bp的一段序列。2.特点富含AT，与SSB结合。3.原核生物（一个）和真核生物（多个）DNA的复制无一例外的都是从复制原点开始。,.,7,二.复制方向1.双向等速复制E.coli,真核生物的染色体复制。2.双向不等速复制枯草杆菌等。3.单向复制质粒ColE1等。,.,8,.,9,图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同复制起点标记的拷贝数应最多,.,10,三.复制方式1.眼型线状双链DNA的复制:单眼或多眼。2.型环状DNA分子双链单向、双向复制均可形成。如E.Coli的复制。,.,11,3.滚环型（型）双链环状DNA分子单向复制的一种特殊形式。DNA复制开始于复制原点处单链的切割，单链5端被单链DNA结合蛋白覆盖，而3-OH端在DNA聚合酶的作用下以未切断的一条环形链为模板不断延伸。整体上DNA的复制是5端不断地甩出3端不断地延长，好象中间的一个环在不断地滚动一样，因而叫滚环复制。其形状象希腊字母，因此又叫复制。连环分子：在型复制中，被甩出的链到达一定的长度后也开始复制最终可得到一种是原来DNA分子若干倍的中间产物，这样的一个分子就叫连环分子,.,12,4.D环复制,环状双链DNA分子进行单向复制的特殊方式。发现于动物线粒体DNA的复制。双链环在复制原点解开，进行单向复制。两条链合成高度不对称，一条链上迅速合成其互补链，另一条则为游离的单链环（即D-环）。,.,13,第三节原核生物复制的酶学,DNA合成酶DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能。,.,14,表11-1E.coli中的三种DNA多聚酶,.,15,(一).DNA聚合酶I的结构,DNA聚合酶有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)53外切酶位点；(6)35校正位点。,.,16,.,17,(二).DNA聚合酶的功能,1.53聚合功能2.35外切活性3.53外切活性（游离的5端；配对）(1)切刻平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转辙（template-switching）4.内切酶活性5.填充缺口,.,18,.,19,.,20,.,21,.,22,(三).DNA聚合酶II,1.结构分子量为90KDa，由polB基因编码。2.功能35外切活性53聚合酶活性,.,23,(四)DNA多聚酶的结构,.,24,.,25,功能：1.53聚合功能2.35外切活性3.53外切活性（游离的5端；单链DNA）无：(1)切刻平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转辙（template-switching）4.填充缺口,.,26,二.DNA连接酶,其作用机制是分三步进行：1、EATPEAMPppi在E.coli中，ENADEAMPNMN（烟酰胺单核苷酸）2、E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化3、活化的5PO4与相邻的3OH作用形成35磷酸二酯键，并释放出AMP。可以链接单链吗？,.,27,三.单链结合蛋白,又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成在E.coli中以四聚体存在分子量为74kD（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。,.,28,四.解旋酶(helicase),.,29,五.旋转酶,22组成，产生负超螺旋来消除DNA复制中由于双链的解开产生的正超螺旋。,.,30,第四节DNA复制的半不连续性,半不连续复制的概念特点两条子代链的生成方向都是从53；两条子代链一条是连续的（母版35），一条是不连续的（母板是53）；两条子代链合成的速度大体相同；连续合成的链总是领先于不连续合成的链，因此前者称为先导链；后者称为后随链;DNA聚合酶（PolIII）实现了先导链和后随链的同时复制。,.,31,三.相关概念引物：1-10个核苷酸组成的RNA,需要1或多条；引发酶：合成RNA引物的酶。E.colidnaG编码；引发体：无或低活性的引发酶与有关蛋白质结合形成的一个有活性的复合体；转录激活：RNA聚合酶通过转录作用解开局部的DNA双螺旋，进而引发体结合到解开的单链的特定序列上，合成引物，启动DNA的复制，该过程被称为转录激活。RNA聚合酶作用：产物直接充当引物、解开双链，供引发体结合合成引物。,.,32,四.冈崎片断的连接带有引物的冈崎片断之间存在缺刻或切口；PolI发挥5-3核酸外切酶活性切除RNA引物（RNAaseH参与），同时发挥5-3聚合酶活性进行切刻平移或缺口填充；DNA连接酶连接切刻两边的相邻核苷酸，产生一条完整的DNA分子。,.,33,五.复制叉处发生的反应,（1）PolIII全酶在两条新生链上进行的聚合反应；（2）DNA引发体和成引物RNA；（3）PolI和DNAaseH切除引物并填充缺口；（4）DNA连接酶将一个个冈崎片断连接到后随链上；（5）DNA螺旋酶解开双链；（6）ssb蛋白结合到解开的单链上；（7）DNA解旋酶产生负超螺旋消除复制叉前进所产生的正超螺旋。,.,34,六.E.coli复制机构的复杂性dnaA：复制起始，作用于oriC；dnaB：引发体组分，6聚体，具有螺旋酶活性；dnaC：引发体组分，6个单体分别结合在6个dnaB六聚体上；dnaE：PolIII的核心蛋白，具有聚合、校对的功能；dnaG：引发酶，合成引物，单体；dnaN：PolIII全酶的亚基，“夹子”；,.,35,dnaQ：较高的保真度，PolIII的亚基；gyrA/B：DNA旋转酶亚基，引入负超螺旋，消除正超螺旋；rep：螺旋酶，解链；ssb：单链结合蛋白，4聚体，防止链间和链内氢键形成；i,n,n,n：引发体及预引发体组分（引物合成有关）。,.,36,第五节DNA复制的起始,前导链和后随链合成的起始。一、前导链合成的起始1、从新起始在复制原点外，RNA聚合酶进行转录激活，解开双链，引发体结合上去，合成一段RNA引物，从而起始DNA复制。,.,37,（1）复制原点与复制起始所有基因组DNA的复制都是从原点开始；DNA复制时，在复制原点外先形成一个复制泡：先导链一经引发并开始合成，与模板形成双链结构；另一亲本链被置换出来，形成三元泡状结构，又叫置换loop/D-loop；先导链继续延伸，另一条链的特殊序列被置换出来，预引发体形成（i,n,n,DnaB），引发体形成（引发酶结合），合成引物，开始复制。,.,38,（2）OriC与E.coliDNA复制的起始oriC的结构特征oriC是E.coli的复制原点，245bp，与复制的起始、终止和染色体在子代细胞之间的分配有关。其结构特征如下：a、（A+T）含量占56%，相对较低；b、除碱基序列高度保守外，某些部分碱基的数目十分保守。+92，+155，+244位点允许突变，不允许插入和缺失碱基；,.,39,c、在oriC中，含有9-14个GATC位点（E.coli为11个）。其中A的甲基化是复制所必需的；d、有4个高度保守的DnaA识别位点：R1、R2、R3、R4。其中R3是R1的正向重复序列，R2是R4的正向重复序列，而R1与R4是互为完全的反向重复序列；e、在oriC中，没有大于20个密码子的开放阅读框。,.,40,.,41,E.coliDNA复制的起始a.转录激活RNA聚合酶结合于16KDa基因的启动子P1和asnC基因的启动子P2，解开双链，发动转录，并终止于oriC（自右向左）。转录的产物或引发体合成的RNA作为复制的引物。b.起始复合物的形成形成条件:负超螺旋的oriC、ATP、DnaA、HU蛋白、TopI。,.,42,负超螺旋的oriC：消除解链过程形成的正超螺旋；ATP：只需ATP的存在，不水解；DnaA：结合于R1-R4位点；HU蛋白：识别并刺激oriC的复制；TopI：oriC特异性复制必需的。,.,43,c.预引发体的形成DnaB-DnaC六聚体与oriC结合形成的。d.RFI*的形成在DnaB的螺旋酶活性和DNA旋转酶作用下，以水解ATP为能源：DNA出现大范围的解链（ssb蛋白结合单链），oriC区域的负超螺旋数提高10-15倍。这样就形成一个迁移率很高的复制形式RFI*（replicativeformI*）。,.,44,e.引发体的形成高度解链的模板与蛋白质的复合体促进DNA引发酶结合到预引发体上，形成引发体，合成引物。f.DNA的合成Pol全酶执行：亚基聚合酶；亚基3-5外切酶活性（校对）；亚基使酶结合到模板链上，保证了全酶很高的进行性。,.,45,.,46,噬菌体DNA复制的起始a.噬菌体DNA早期复制为型复制，晚期为滚环型复制。这里我们只讲早期复制。b.复制原点的结构4个高度保守的由19bp组成的正向重复序列，称oriC重复序列；约40bp组成的富含AT序列（80%）；28bp的回文序列，中间4bp的不对称部分。与复制密切相关的是前两个区域。,.,47,.,48,c.复制的起始PROR处发动转录激活引起起始区结构的变化（解链），ssb蛋白结合，转录了复制所必需的基因产物：O蛋白和P蛋白。,.,49,O蛋白体的形成4个O蛋白与DnaA作用相似（复制起始有关），它与ori区域的4个正向重复序列结合。引发体形成2个P蛋白相当于DnaC，可促使2个DnaB与ori结合，引发酶加入进来，合成引物。DNA合成Pol全酶在富含AT区实现了RNA向DNA的转变。,.,50,T7噬菌体DNA复制的起始39936bp，线状双螺旋。a.复制原点位于基因1和基因1.1之间，包括基因1.1的两个启动子序列（23bp高度保守）和一段61bp富含AT（78%）序列（7个回文序列TTAA、一个基因4产物的识别位点3-CTGGG-5）。,.,51,b.参与复制起始的酶3种：T7RNA聚合酶、T7DNA聚合酶、基因4蛋白T7RNA聚合酶：基因1产物，单肽链，转录激活；T7DNA聚合酶：两个亚基构成（1:1比例结合）T7的基因5蛋白：单链、3-5外切酶活性、低的聚合酶活性（1-50b）；寄主基因硫氧还蛋白：结合后，具有单双链3-5外切酶活性、聚合酶活性（进行性）很高。基因4蛋白：2种形式(58KDa,66KDa),具有三磷酸酯酶、螺旋酶、引发酶的作用。,.,52,c.复制起始过程转录激活：T7RNA聚合酶利用基因1.1的2个启动子中的任何一个发动转录，合成复制的引物；RNA-DNA的转换：转录产物RNA延伸到AT区域的某一位点时，被T7DNA聚合酶作为引物开始先导链的合成；,.,53,后随链的起始：由于转录作用置换出一条单链（后随链的模板链），基因4蛋白迅速结合上去，沿着模板链5-3方向移动（能量来自三磷酸酯酶水解dNTP产生的能量），移动过程中，发挥螺旋酶作用解开双链使另一条链能顺利复制。当基因4蛋白遇到5-GGGTC-3或5-TGGTC-3序列时，行使引发酶的功能，合成互补的引物pppACCC或pppACCA，然后由T7DNA聚合酶起始后随链DNA的复制。,.,54,转录激活必需的步骤：解开双螺旋、有利于引物的合成或直接作为引物、转录出某些控制复制的蛋白质因子的基因（如噬菌体的O/P基因）。复制原点的必要结构蛋白质因子识别的序列；富含AT序列：容易解链、容易产生RNADNA的合成转变。,从新起始的共同点,.,55,一、前导链合成的起始2、共价延伸前导链的合成是在一条断裂的亲本链的3-OH上不断的发生DNA聚合反应，该过程不需要从新合成RNA引物，因此称为共价延伸。如滚环复制。如174噬菌体的复制,F因子DNA的转移,真核rDNA的扩增,噬菌体后代线形DNA的产生。,.,56,a.174噬菌体的噜噗滚环复制长度：1倍/n倍产物：双链连环分子/单链环状结构,.,57,b.接合过程中的滚环复制Hfr雄性细胞,.,58,c.真核生物中的基因扩增现象：非洲爪蟾卵母细胞rRNA基因有500个重复单位（72h内扩增4000倍）；从基因组染色体上切下一个单元，环化；滚环复制从连环分子上再切下重复单位环化，滚环复制,.,59,d.噬菌体在裂解生长后期利用滚环复制产生后代线形DNA滚环复制；从连环分子上的cos位点切割，包装；或复制产生环状单体；单体二聚体化；在cos位点切割，包装。,.,60,二、后随链的前体片段合成的起始由于E.coliDNA复制体系的复杂性，目前有关其后随链冈崎片段的起始机制还了解的不太清楚。人们换位思考，因为有关E.coli的一些单链DNA噬菌体研究较多，如M13/G4/174。这些噬菌体在复制过程中，全部或大部分使用E.coli的复制酶系和蛋白质。因而对噬菌体复制的研究将有助于我们了解E.coli的复制机制。,.,61,单链环状DNA双链环状DNA（RF）双链环状超螺旋DNA（RF）。复制过程中大部分或全部使用寄主的复制酶系和蛋白质。,.,62,1、M13噬菌体DNA（1）结构6407个碱基，第5480至第5820个碱基之间有五个发夹结构，第三个最为重要，有59个碱基。（2）复制过程M13噬菌体进入寄主细胞后，寄主的SSB蛋白就结合于单链部分。,.,63,而RNA聚合酶能识别发夹结构，从第5756碱基开始转录出20-30碱基的RNA，从而破坏了发夹结构，转录停止。SSB再结合于暴露出来的单链部分。然后，DNA聚合酶以转录出的RNA为引物，开始互补DNA链（负链）的合成。由于引物RNA是由于寄主的RNA聚合酶合成的，因而M13的互补的负链的合成对于利福霉素是敏感。,.,64,2、G4噬菌体（1）结构单链环形DNA（5577b），基因F和G之间有一段与负链复制有关的序列，该序列两端为两个同向重复序列，中间包含三个发夹结构。,.,65,（2）复制过程负链合成的起始与M13相似，差别是引物RNA是由寄主的引发酶合成的。起始不受利福霉素的影响。M13与G4相同点：复制原点处都有发夹结构；基本要素为SSB蛋白、引发酶（或RNA聚合酶）和DNA聚合酶、DNA聚合酶以及DNA连接酶。,.,66,3、174噬菌体（1）结构环状单链DNA，当它进入寄主细胞后，单链DNA上全部结合有SSB蛋白。复制原点也在基因F和G之间。约55个碱基，有一小段发夹结构。（2）负链复制的起始a.174DNA进入宿主细胞E.coli后，ssb蛋白结合到单链DNA上；b.位于基因EF之间的174DNA的复制原点约55b，能形成发卡结构，不被SSB蛋白结合，为裸露的双链；,.,67,c.预引发体形成n,DnaB,DnaC,i,n,n装配成一个复合体结合于发卡结构；d.引发体形成预引发体形成后，引发酶加入进来，形成引发体，引发体的装配如下：,.,68,e.引物合成Pol在引物的3-OH末端发生DNA聚合反应；f.引发体沿单链DNA5-3移动引物合成后，n水解与之结合的ATP，使DnaB变构，降低了其与单链DNA的亲和力，使整个引发体沿5-3方向移动，直到发现其引发位点再合成另一个引物。Pol结合上去进行DNA合成，直到相邻一个引物处停止。,.,69,（3）负链复制的过程174DNA的正链上含有多个引发位点，在引发体的作用下，在这些位点分别合成一段RNA引物；Pol以引物为依托，合成DNA到另一个RNA引物处；Pol发挥5-3外切核酸酶活性水解引物RNA；Pol发挥5-3聚合酶活性填充缺口；DNA连接酶连接切刻两端的碱基形成共价封闭环；DNA旋转酶作用形成负超螺旋。具有负超螺旋的双链共价封闭环即为174的复制形式I（RFI），带有切刻的双链环状DNA称为RFII。,.,70,.,71,（3）174DNA的复制，主要可分三个阶段SSRF：亲本单链DNA（+）链转变成共价闭合环状双链超螺旋DNA（RF）。这一段复制过程全部使用寄主的蛋白质（包括酶）。多拷贝RF的合成：特点在于多功能的基因A蛋白从RF的（-）链进行噜噗-滚环复制。后代单链DNA（+）链的合成，即RFSS。主要是噬菌体颗粒的装配。,.,72,.,73,比较174、M13、G4负链的复制174中，预引发位点只有一个，引发位点有许多个；M13、G4中，合成一个引物，然后DNA合成到底。负链复制的其余步骤上，三者完全一样，由DNA聚合酶以引物RNA为依托，合成DNA直至引物RNA处；由DNA聚合酶的53外切核酸酶活性水解引物RNA并代之以DNA；最后由DNA连接酶连接成共价封闭环。继而由DNA旋转酶形成负超螺旋。这时有负超螺旋的双链共价封闭环即为这三个单链环状噬菌体的复制形式（RF）。在连接酶连接之前，带有切刻的双链环称为复制形式（RF）。,.,74,三、由复制体进行先导链和后随链的同时复制1、复制体（replisome）DNA聚合酶的全酶与引发酶、螺旋酶等组成参与DNA复制的复合体。2、复制体介导两条链同时复制的过程Pol上有两个活性位点：一个催化前导链的合成；一个催化后随链的合成；,.,75,两条链合成的方向如何一致？,.,76,后随链的模板绕酶旋转180度，形成一个噜噗，使冈崎片段的合成方向与复制体移动的方向相同；,.,77,随着冈崎片段的延长，噜噗不断扩大。,.,78,当冈崎片断合成到前一个片断的5端时，大噜噗释放；在此之前，先导链的合成又将另一部分后随链的模板置换出来，并在引发位点由引发体合成新的引物；,.,79,后随链模板旋转180度，形成一个新的小噜噗，进行新的冈崎片段的合成；周而复始完成整个DNA分子的复制；在整个复制过程中，需要螺旋酶作用解链（DnaB,Rep）；旋转酶解决超缠问题。,.,80,第六节DNA复制的终止,一、环形DNA复制的终止(1)单向复制的环形分子它的复制原点就是其复制终点。(2)双向复制的环形分子大多数没有固定的终点，只是两个生长点的简单碰撞。(3)环形分子复制的最后一步2个环连分子的分离，由拓扑异构酶催化。,.,81,E.coli的复制终止现已发现有两个终止区域（terE,D,A和terC,B：反向重复），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。终止需要tus(terminusutilizationsubstance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实现终止,.,82,.,83,二、线形DNA复制的终止1、末端冗余（隐缩）,2条子代链的5端由于RNA引物的降解而缺少一段核苷酸。由于没有3-OH的存在，DNA聚合酶无法填补。这样，就会导致子代链越来越短。,.,84,2、解决末端冗余（隐缩）的途径,（1）环化办法线形DNA直接环化形成超螺旋，再进行复制。,.,85,（2）T7噬菌体DNA与连环分子的形成与分解,与单链末端清除相关的酶T7的基因3产物：一种DNAase,分子量18000Da，是内切核酸酶，具有单链特异性。基因6产物：5-3的外切核酸酶。两种作用：其一是水解细胞的DNA提供噬菌体DNA合成的核苷酸前体；其二是去除引物RNA(T7DNA聚合酶不具备5-3外切酶活性)。T7DNA复制中产生的末端隐缩的特征T7DNA的两端各有一段正向重复序列，这就决定了两条子代链的单链末端可以互补。,单链末端清除的过程,a.两条子代链发生退火现象，互补的3端配对；b.多余的没配对的部分被DNAase切除（基因3产物）；c.DNA连接酶将两个子代DNA分子连接起来，形成一个二聚体-连环分子；d.二聚体-连环分子通过复制可产生四聚体、八聚体连环分子及巨大的连环分子；e.T7DNA分子随时从连环分子上切除。步骤：连环分子（特异性内切核酸酶）产生具有粘性末端的两个DNA分子（3-OH）（T7DNA聚合酶）粘性末端被补齐形成完整的子代分子。,.,87,.,88,（3）借助蛋白质分子来解决线形分子末端隐缩问题,以腺病毒(Ad：哺乳动物的病毒，线形双链，3.6万碱基对)为例：Ad的复制原点AdDNA的两端有反向重复序列（103-162bp）。在线形DNA分子两端各50bp范围内有两个复制原点。其中第一个碱基对CG、第9-18bp、第24-50bp(NF1结合位点)高度保守，前2者完全保守。在复制原点前25bp中，AT含量达80%。,复制过程,核因子(NF1)与其结合位点结合在DBP（单链结合蛋白，具有螺旋酶活性）、ATP存在时，末端蛋白（TP,55KDa）催化使末端解链AdDNA聚合酶（AdPol）催化pTP的丝氨酸残基与dCTP之间形成磷酸二酯键，与此同时C与模板3端的G在AdPol的作用下，一条链复制，另一条链被置换出来置换链形成平锅柄形式采用相同的方法进行复制。,.,90,.,91,枯草杆菌噬菌体29与腺病毒十分相似。自身编码27kDa的末端蛋白质和DNA聚合酶是复制必需。灰质炎病毒其5末端也通过磷酸二酯键与VPg蛋白的酪氨酸残基相连。VPg只有22个氨基酸。前体分子量12kDa，与细胞膜相连，可能就是参与引发过程的蛋白质。负责RNA复制的RNA聚合酶称为RNA复制酶，与DNA聚合酶一样，严格依赖于引物。,.,92,第七节真核生物DNA的复制,一、基本概念(1)复制原点多原点双向复制。没有固定的模式：大多含有富含AT的序列，特异性蛋白质的结合位点。(2)复制元（replicon）复制原点到复制终点（两边）的所有区域。(3)复制元族若干个邻近的复制元就形成一个复制元族。每个复制元族含2-250个复制元，同一复制元族内各复制元的复制基本上是同步的。,.,93,二、真核生物的DNA聚合酶和引发酶1、DNA聚合酶DNA聚合酶：多亚基，核内，参与DNA复制；DNA聚合酶：单亚基，核内，参与DNA损伤修复；DNA聚合酶：单亚基，线粒体内，功能不祥；DNA聚合酶：单亚基，位于核内，具有3-5外切酶的活性，功能可能是协同DNA聚合酶进行DNA的复制。,.,94,2、引发酶分子量50-60KDa，合成引物。其性质如下：（1）DNA引发酶与DNA聚合酶紧密结合形成复合物该复合物是复制所必需的，而且它与结合在复制原点的特异性蛋白质构成复制体系的种族特异性。即同一种族的复合物与蛋白质结合能启动复制（同为灵长类的人和猴子），不同种族（人与鼠、牛）的复合物与蛋白质不能启动复制。,.,95,（2）引物的合成方式是阵发式的每次只能合成6-15个核苷酸；当DNA聚合酶少时，引物是多次阵发性合成的多聚核苷酸；当DNA聚合酶活性很高又有充足的dNTP时，复制的引物就是第一次阵发性合成的产物。（3）DNA引发酶既能利用rNTP，也能利用dNTP作为合成引物的前体在每次阵发性合成的引物中，第一个核苷酸总是rA；而以后的核苷酸要么都是清一色的核糖核苷酸，要么都是脱氧核糖核苷酸。,.,96,三、SV40（猴肾病毒）的大T抗原与复制原点1、SV40是研究真核生物DNA复制的主要模型染色体具有核小体结构双链环形DNA分子，5243bp，是具有核小体结构的微染色体。SV40的整个复制机构（除大T抗原）都来自寄主蛋白质基因组小、核小体结构、使用宿主的复制体系决定了它是真核生物DNA分子复制的模型,.,97,2、大T抗原由SV40DNA编码的蛋白质，四聚体，在SV40DNA复制原点上有三个结合位点，同时还具有ATPase活性和螺旋酶活性。它还与某些特异的蛋白质发生相互作用。,.,98,3、SV40DNA复制原点位于5192-5243（0）-30共82bp的序列。其中包括大T抗原的结合位点和、连续的16bp的AT序列、RNA-DNA转变位点。,.,99,4、SV40DNA复制的过程大T抗原结合于复制原点的TagII（含27bp的回文序列）；大T抗原发挥螺旋酶活性促进富含AT区域的解链；单链DNA结合蛋白RF-A结合到解开的单链上，使之稳定，解链区与以动态方式向两侧传播；,.,100,单链DNA序列上的引发部位暴露出来；DNA引发酶-Pol复合体结合上去，合成引物；,.,101,在RF-C（具有ATP酶）作用下，Pol以引物为依托，合成右向复制叉的第一个冈崎片断；到了左向复制叉前导链和右向复制叉后随链的分界区，Pol与引发酶复合体从单链解离，再结合到右向复制叉其他引发部位，合成后随链；,.,102,Pol和PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）结合到第一个冈崎片断3端开始合成前导链；前导链在Pol的催化下，后随链在Pol-引发酶催化下完成合成；,.,103,SN40DNA的复制没有固定的终点，只是2个复制叉简单的碰撞。复制完毕时形成一个环连体分子，在拓扑异构酶II的作用下发生去环连作用。,.,104,.,105,.,106,原核和真核生物复制体系的比较,E.coliSV40/人功能DnaAOT抗原起始蛋白DnaBDnaBT抗原解旋酶DnaCP?装配因子DnaGDnaGPol-引发酶引发酶Pol的亚基Pol聚合酶Pol的亚基Pol校正Pol的亚基PCNA滑动钳复合体RF-C滑动钳装配器SSBRF-A单链结合蛋白,.,107,5、真核生物染色体末端DNA的复制(1)线形DNA，同样存在末端隐缩问题。(2)端粒和端粒酶可解决这一问题端粒酶一种核糖核蛋白，由RNA（富含C的序列）和蛋白质构成。它实际是一种逆转录酶，它的模板是自身的RNA。端粒真核生物染色体末端都有的一个特殊结构，是一个短片断的重复结构，如四膜虫-TTGGGG-。,.,108,末端隐缩的消除a.以端粒酶RNA3-AACCCC-为模板，以端粒DNA的3为引物，在其逆转录酶活性的作用下，以（T2G4）的方式延伸3末端；,.,109,b.延伸链回折以GG配对形成发卡结构或通过四链DNA形成拓扑结构，产生端粒。,.,110,6、真核生物复制过程中的核小体结构（1）组蛋白是以全保守的方式进行装配的；,.,111,（2）新的组蛋白八聚体与老的分别位于两条子代DNA分子上（偏袒分布）；,.,112,（3）从SV40的研究看，新的八聚体结合在后随链上，老的八聚体结合在前导链上。,.,113,作业一、名词解释复制原点、连环分子、切刻平移、链的置换、模板转辙、引发酶、引发体、转录激活、共价延伸、复制体、复制元、复制元族,.,114,作业二、问答题1、DNA复制的方式有哪些？2、简述原核生物DNA聚合酶、的结构和功能。3、简述原核生物DNA复制叉处发生的反应。4、简述大肠杆菌复制原点的结构特征。,.,115,作业5、原核生物线形DNA复制中如何解决末端隐缩问题？6、真核生物引发酶的特点是什么？7、试述SV40DNA复制的过程。,.,116,第四、五章转录和翻译,一、转录1、RNA聚合酶原核：2：与底物的结合，催化磷酸二酯键的形成；：与有义链的结合；：参与全酶和启动子的牢固结合，解链；：识别启动子,.,117,.,118,.,119,真核：三类RNA聚合酶I：核仁，5.8SrRNA、18SrRNA和28SrRNA；RNA聚合酶II：核质，mRNA、部分snRNA；RNA聚合酶III：核质，tRNA、5SrRNA、Alu序列、部分snRNA。,.,120,2、原核生物的启动子结构含有识别（R）、结合（B）、起始位点（I）和上游部分CAP-cAMP结合位点（位点I和位点II）：,.,121,典型启动子的结构,-35-10转录起点TTGACA16-19bpTATAAT5-9bp,.,122,大多数基因的启动子结构,.,123,-10序列：TATAAT,决定转录的精确位置-35序列：TTGACA,决定转录的效率CAP位点：结合cAMP-CAP的二元复合物，进而促使RNA聚合酶结合，解链,.,124,正调控