人类基因组计划课件

,Humangenomeproject,人类基因组计划,河南师范大学生命科学学院卢龙斗,第六章(3),一、何谓人类基因组计划1、人类基因组计划：（HumanGenomeProjet)简称：HGP。测定人类基因组核苷酸的排列顺序、基因排列顺序、揭示基因的功能以及基因间的相互关系，从而解码生命的计划。2、基因：(Gene)DNA上具有一定的遗传效应的核苷酸序列3、基因组：(Genome)又叫染色体组，指一个生物物种配子中的一套染色体或全部基因。1920年，德国遗传学家温克勒把Gene和Chromosome缩合创造了基因组这个词。在人类指包括X、Y在内的24条染色体,4、基因组学：（genomics）从整个基因组的视角来研究遗传学的科学。研究基因组及其基因的科学5、结构基因组学：（Structuralgenomics）研究基因组的物理特点的科学6、功能基因组学：（Functionalgenomics）研究基因组中基因的产物和表达模式的科学（后基因组计划）7、基因组文库：（genomiclibrary）整个生物体基因组随机产生的重叠DNA片段的克隆的总和,8、基因库：genebank某一生物群体中全部个体所共有的全部基因9、蛋白质组：proteome在某种细胞或组织中整个基因组所产生的各种蛋白质的组合。由基因组编码的全部蛋白质总合10、蛋白质组学：proteomics研究一个基因组中基因编码的所有蛋白质的结构、功能以及相互作用模式的科学11、转录组；transcriptome某一特定组织在某一特定时间由基因组转录形成的全部RNA总合12、工作草图：人类基因组计划最终目标的中间阶段,13、完成图：高水平、高质量、精细的人类基因组框架14、酵母人工染色体：(YAC)能携带人类基因组1000000碱基的、能在酵母菌中复制的一种载体15、细菌人工染色体（BAC）能携带人类基因组300000碱基的、能在细菌中复制的一种载体16、塞莱拉公司：（Celera公司）1998年CraigVenter创建的快速测序的专门公司。Celera在拉丁语意为快速的、发现了决不等待。与美国国立公司公开竞争。,二、人类基因组计划的由来1、19721982年，美国庞大肿瘤研究计划最后失败80年代，由于分子生物学的发展，人们试图彻底解决生物学问题，提出了遗传工程计划、讯号传导计划、脑的十年计划、蛋白质计划等，都没有解决根本问题，特别是美国庞大肿瘤研究计划最后失败，使人们思考从另外一个角度解决问题2、1983年，美国能源部负责核武器研制的两个国家实验室洛斯阿拉莫斯实验室、劳伦斯利佛摩尔实验室，提出，要研究日本广岛、长崎幸存者基因突变情况，必须把人30亿碱基对搞清楚。1984,年12月国能源部讨论此方案，1986年3月决定实施3、1986、3、7美国著名生物学家杜尔贝（Dulbecco)在科学杂志发文癌症研究的转折点人类基因组的全序列分析。“现在我们不应再东一棒子西一榔头按喜好去研究各自感兴趣的基因，这样只会事倍功半，我们应集中力量去解读整个人类基因序列，描绘出人类自己的设计图，这才是正道”。“这一计划的意义，可以与征服宇宙的计划相媲美我们应该以征服宇宙的气魄来进行这一计划。”“这样的工作任何一个实验室都难以承担，它应该成为国际性的项目，人类的DNA序列是人类的真谛，这个世界上发生的一切事情，都与这一序列息息相关,4、1987年3月美国能源部、国家健康研究院拨款550万美金筹建人类基因组计划实验室。能源部健康和环境研究室主任CharlisDelisi在计划启动上作了关键作用，因此，他被称为人类基因组计划之父,5、1988年12月美国国家科学研究委员会组织撰写（人类基因组做图测序）报告全面介绍人类基因组计划成立“国家人类基因组研究中心”由华生担任第一任中心主任6、1990年美国国会正式批准人类基因组计划，10月1号人类基因组计划正式启动，计划在15年内，投资30亿美金，破解人类生命密码的天书。,在Dulbecco论文的影响下，整个西欧都动了起来7、1987年意大利组织30个实验室开始HGP8、1989年英国成立“英国人类基因组资源中心9、1990年法国宣布开始人类基因组计划，法国民众踊跃捐款5000万美金10、1990年日本启动人类基因组计划11、1995年德国启动人类基因组计划。先后又有澳大利亚、丹麦、荷兰、俄罗斯、西班牙、瑞典、斯里兰卡共有15个国家参与12、1998年美国克来格文特尔博士（CraigVenter)创立塞莱拉基因公司(Celera)，展开竞争,13、1999年9月中国正式加入国际基因组测序俱乐部1988年中国已有40多名科学家加入俱乐部1993年中国国家自然科学基金已经资助杨焕明1988年在丹麦获博士学位，后在法国、美国作博士后，1994年回国，任人类基因组计划中国项目执行人。又有于军、刘斯奇、王建等把技术带回国内，又呼吁、又推波助澜浙江温州乐清市市长陆光中资助800万元北京顺义区免费提供实验基地人基因组测序战略第五次会议杨焕明5分钟发言,1998年中科院院士陈竺在上海挂帅成立中国南方基因组中心1998年杨焕明、余军在中科院成立中国科学院遗传研究所，专门从事人类基因组研究1999年中科院院士强佰勤挂帅成立中国北方基因组中心主任1999年陈竺院士成为国际基因组委员会委员,三、人类基因组计划的任务和内涵1、人类基因组计划的任务1）人类基因组的基因图构建与序列分析（遗传图谱、物理图谱、序列图谱、基因图谱）2）人类基因的鉴定3）基因组研究技术的建立4）人类基因组研究的模式生物（细菌、酵母菌、线虫、果蝇、小鼠、拟南介）的基因组5）信息系统的建立6）有关的伦理、法律和社会问题研究,2、后人类基因组计划1）绘制基因组遗传整合图（单体型图）寻找不同人群之间、不同人之间的差异，建立“个人医学”美国31%、英国24%、本25%、加拿大10%、中国10%。（3、8、21染色体）。单核苷酸多态性研究（SNP)2）功能基因组学是人类基因组计划的核心和焦点，主要是对基因组进行功能研究，对非编码区进行基因调控功能的研究3）比较基因组学揭示生命起源，解决生物进化的重大问题。比较人类与细菌的基因组，筛选出仅在细菌中存在的基因，成为新的抗菌素药靶,4）蛋白质组学在蛋白质水平研究基因的功能，翻译后的修饰机理蛋白质的生化功能、蛋白质之间的相互作用、借助计算机技术，模拟出未知蛋白基因的蛋白质产物的立体结构，预测蛋白质的功能5）医学基因组学6）环境基因组学：肌体在恶劣环境下敏感性基因和抗性基因的活动规律7）药物基因组学：研究不同个体不同的基因多态性对药物的反应，指导科学用药,8）病理基因组学：不同个体发病情况和基因活动情况9）生殖基因组学：受精、个体发育中基因活动情况10）群体基因组学：11）生物信息学：由于人类基因组计划的实施使生命科学与信息科学相结合而产生的交叉学科。通过对生物学实验数据的获取、加工、存储、检索和分析，揭示数据所蕴藏的的生物学意义。,四、人类基因组计划的核心内容1、遗传图谱（连锁图谱）1）概念：人类基因组内基因以及专一的多态性DNA标记相对位置的图。以某个遗传位点上具有多个等位基因的遗传标记做“路标”，以两个位点之间进行交换、重组的百分率cM作为图距反映基因遗传效应的基因组图。基因组计划启动时人类学研究已将1.6万个基因确定了相对位置2）图距单位：cM，相对距离3）图谱意义：育种的字典、基因组测序的路标,4）图谱的遗传标记：遗传标记指可以识别的等位基因或一些等位性的片段。随着分子遗传学的发展和基因概念的发展遗传标记也在不断从形态、细胞水平发展到生化和分子水平原始遗传标记：为性状标记，人类的双眼皮、单眼皮，男性、女性，色盲、正常，血友病、正常，多指、五指等。由于人类已经了解的性状非常少、（人类大约了解的性状有几百个）这些性状的,多态性又少，而且每一个性状都是由许多基因控制的，因此，性状作为遗传标记来进行人类的基因组计划显然是不行的第一代遗传标记：为蛋白质、同工酶或免疫学的标记，如A,B,O血型位点、HLA位点、MN血型位点、Rh血型位点等。但是，已知道多态的蛋白质很少，等位基因的数目少，在2米长的“路上”路标太少，不易找到人们要找的目标第二代遗传标记：限制性片段长度多态性：RFLP遍布在人类基因组中，可达105以上。工作原理是用限制性内切酶特异性切割DNA链，DNA上一个点的变异造成“能切”，“不能切”，因而产生不同长度的等位片段在凝胶电泳上显示，从片段多态性的信息与疾病,表型间的关系进行连锁分析，找到致病基因。RFLP标记的优点：无表型效应，检测不受环境和发育阶段影响共显性杂交组合时不受杂交方式影响互相之间不存在上位效应，忽不干扰源于基因组自身的变异，在数量上几乎不受限制因此，1987年，建立了人类第一张RFLP图谱，有393个RFLP标记，10多个其他标记，密度10MbRFLP标记的缺点：一种酶切割一个位点时只能产生23个多态性片段，因此，提供的信息量有限真核生物基因组大，酶切后产生数百万片段，不易分析需要放射性同位素标记DNA探针来检测RFLP，存在安全性和费用问题,小卫星标记：VNTR1985年微卫星标记：STR1989年发现。又称简单重复序列（simplesequencerepeatSSR)1996年已经建立了6000多个此种标记，标记之间距离为0.7cM第三代遗传标记：单核苷酸多态性:(singlenucleotidepolymorphysm)SNP.1996年发现，大多数基因位点上都有若干个等位型，每一个核苷酸在任何一代人群中大约每1109个个体就会发生一次变异,简单序列长度多态性SSLP,人类基因组中有此标记300万个，平均每1000个碱基就会有一个。在基因组中数目多、覆盖面大，可以用基因芯片操作，所以，具有优越性和潜力5）图谱缺陷标记密度小：真核生物尤其人类可利用的交配组合、连锁后代少，可利用的研究个体不容易获得，因此，已经有的遗传标记较少，在计划开始时，人类遗传图谱才几百个，而计划需要至少3万个标记分辨率低：平均600kb才有一个标记，既分辨率仅600kb，而人类基因组计划测序,需要100kb的分辨率一个标记的密度精确性不高：相对位置、相对距离、由于交换不是当年摩尔根描述的那样，因此，已经得到的数据不准确，不能用于基因组测序2、物理图谱（生命周期表）1）概念：限制性酶切位点、序列标签位点等在基因组的位置和距离的图利用分子生物学技术直接确定一些DNA序列的位置的图2）图距单位：bpkbpMb3）图谱意义：是生命的元素周期表，与遗传图谱结合进行精细基因定位，是基因组测序的必经步骤,4）图谱的标记：限制性酶切位点：例如Alu识别序列为AGCT,则平均每256对核苷酸就有一个切点EcoR识别序列为GAATTC则平均每4096对核苷酸就有一个切点.不能用于大的基因组序列标记位点：（sequencetaggedsite,STS)一段长100500bp、易于识别的、仅存在于待研究的基因组中的DNA序列.一个STS必须是序列已知、在染色体上有唯一位置,一个1000bp的DNA分子,用酶A、酶B、酶C切割，得到如下片段（厦门大学考研试题）酶A切割、1000bp酶B切割、100bp、300bp、600bp酶C切割、200bp、800bp酶AB切割、50bp、100bp、300bp、550bp酶BC切割、75bp、100bp、125bp、225bp、475bp酶AC切割、200bp、375bp、425bp确定此三种限制性内切酶在此DNA分子上的位置,1、根据酶A切得到一个2、根据酶B切得到三个片1000bp的片段BC,说明段，100bp、300bp、该DNA分子为环状，600bp，说明酶B在此环酶A在其上有一个切点状DNA分子上有三个切点,A,B,B,B,600,100,300,3、根据酶C切得到200、800二片段，说明酶C在此环状DNA上有2个切点4、根据AB双酶解时得到50、100、300、550四个段，与A、B单酶解时比较，与酶B单切时比较是多了一个50，但出现了一个550，正好是酶B切的600的分割,C,C,200,800,AB,B,B,550,50,100,300,B,B,B,A,550,50,300,100,5、根据酶BC得到756、根据A+C酶切得到200100、125、225、475五375、425、单独C切得到200、800。375、425刚个片段，75+225=300，好是800的分割，所以，A是300得分割、475+125酶切点在800上=600，是600的分割,B,B,B,C,C,B,C,C,B,B,A,475,125,75,225,100,50,100,225,75,125,475,AB,B,B,C,C,首先确定切点多的酶的切点,最后确定切点少的酶的切点确定B的三个位点,再确定C的两个位点,最后确定A的一个位点（A若在下面则酶A、酶C共切时切不出200bp片段）,酶A切割、1000bp1步、酶B切割、100bp、300bp、600bp酶C切割、200bp、800bp酶AB切割、50bp、100bp、300bp、550bp2步、酶BC切割、75bp、100bp、125bp、225bp、475bp3步、酶AC切割、200bp、375bp、425bp,表达序列标签：(expressedsequencetag,EST)通过互补DNA克隆分析获得的短序列。是cDNA的3端或5端的序列。300500bp.每一个EST代表一个表达基因的部分片段。是基因的转录非翻译区。是序列标记位点的源泉，通过它可以寻找基因5）取得的成绩：1995年以STS为物理标记，约16000个STS位点已经定位，把基因组分成了16000个小区。平均间距：200kb。以后达到了20104个STS位点，基本达到了100kb一个标记的密度。物理图谱=里程碑=生命周期表6）物理图谱与遗传图谱的关系,项目遗传图谱物理图谱标记基因多态性序列STS单位cMbpkbMb信息生物信息物理信息标志路标界标距离相对距离绝对距离位置连锁关系相对位置位置关系绝对位置分辨率低,600kb高，100kb精确性低高操作难度大容易,3、序列图谱（人类基因组计划的核心）1）概念：人类基因组30亿对核苷酸的排列顺序的图2）测序流程：选择物种分离DNA获得大量DNA切割成重叠片段片段插入载体组装测序大量克隆,3）测序方法0年前，一台仪器每天只能测00bp，人类基因组测完需要8000年，因此，有人激烈反对此计划，985年发明的第一台测序仪仪每天测15000bp，以后有加速到00000bp1998年发明ABI3700DNA分析仪、MegaBACE1000DNA测序仪每分钟既可测12000bp，不到个月就测完了人类基因组的0北京中心每天可测千万bp，是世界上第六大测序中心费用也从开始的每碱基10美元降到了10美分,链终止法(977,Sanger)原理1:聚丙烯酰胺凝胶电泳可以把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开原理2：复制时ddNTP一旦结合上去，就使其它核苷酸不能再往上结合，(ddNTP缺少可连接下一个核苷酸的3羟基）形成长短不一的单链DNA分子每个反应器中有35单链DNA53引物DNAKlenow酶仅具35外切活性dNTP其中dATP是32P标记的ddATP是双脱氧的,dNTPdNTPdNTPdNTPddATPddTTPddCTPddGTP,反应器反应器反应器反应器,ddATPddATPddATPddATP,各反应器中的dNTP都用32P标记，利于电泳后观察,1234ATCG,1234ATCG,5TGATACGACGAAGTACTGG33ACTATGCTGCTTCATGACC5,链终止法测序中的DNA聚合酶的要求：高延伸性：能保证在渗入链终止核苷酸之前合成的链片断不与模版链解离不具备或很弱的53外切活性：保证新合成的链不被酶切掉不具备或很弱的35外切活性：保证新合成的链不被酶切掉Klenow酶：大肠杆菌聚合酶被枯草芽孢杆菌素裂解后产生的一个大片断。具有聚合活性和35外切活性。但聚合活性较低。测序酶：T7噬菌体编码的一种修饰过的DNA聚合酶。延伸性高、无外切活性、反应速度快可用多种修饰过的核苷酸作引物。,热循环测序法：（1992）用双链DNA，用量少，不必大量克隆用热稳定聚合酶Taq酶，单条引物，类似PCR反应荧光标记引物法：不同的荧光标记加在不同的核苷酸上，在同一个反应器中同时加入4种荧光标记的双脱氧核苷酸，电泳时加入同一个泳道中，电泳条带通过检测仪时，可以直接读出核苷酸，电脑把核苷酸序列打印在表格上。每次一个样品。,毛细管电泳法：新的测序仪改为毛细管电泳，有96个孔道，一次能测96个，每次2小时。焦磷酸测序法：不用合成、分离不同长度的片断，不用电泳，不需要加入ddNTP。直接进行模版链复制，边复制边测序。每种核苷酸用不同荧光色标记，每次加入一种核苷酸，反应结束后，剩余的核苷酸会被分解掉，接着加入另一种核苷酸。结合上去一个核苷酸，计算机就读出一个序列。,如何加快测序速度和进行计算机阅读每一种双脱氧的核苷酸可以被标记上不同的荧光染料,如T被标上红色、G被标记上兰色、A被标记上绿色、C被标记上黄色。把凝胶放在特殊的仪器上当片段在凝胶上移动时，他们会在某一点穿过一个激光束，标记在各种核苷酸的染料就会被激发而发出不同的荧光，此种荧光信号被探测器捕捉而在计算机显示器上显示为相应色带，由计算机直接读出核苷酸的顺序,）取得的成绩：框架图精细图完成图覆盖人类基因组的99.9%基因组核苷酸数目：31.647亿bp，一个个核苷酸排列起来可达到5000公里长，500页的书3000本才能写完基因数目：3.03.5万个，比果蝇、线虫多2万个，为水稻的二分之一，61%与果蝇同源.43%与线虫同源.46%与酵母同源，17号染色体上全部基因都可在小鼠11号染色体上找到热点和荒漠：17、19、22号染色体基因集中。X,Y4、8号染色体基因贫瘠，基因组1/4区无基因存在编码序列：仅占基因组的5%基因组重复序列：基因组的36%包含重复序列，19号染色体57%区为重复序列，重复序列占整个基因组的50%以上。插入重复、反转录后整合的假基因、简单重复、片段性重复、串联重复基因组差异：人与人之间基因组99，99%是相同的，差异仅万分之一，不存在优秀基因组之说。不存在白种人基因组、黄种人基因组。人类只有一个基因组。,基因组30亿,基因和相关序列20-30%,基因外DNA70-80%,非编码序列,编码序列,中高重复,单低拷贝,内启前尾,拟基因,基因断片,分散重复,簇状重复,SINE,LINE,卫星DNA,小卫星DNA,微卫星DNA,人类基因组与黑猩猩的相似性达到96%,约有4000万碱基对差异,其中这些差异的绝大部分位于非功能区,仅有300万对位于功能基因区.黑猩猩缺乏人类的50个基因,其中3个与炎症有关.人类缺乏黑猩猩的1个基因.人类基因组与黑猩猩的基因组核苷酸序列差异约在编码序列中差异小于1.5%，非编码区差异小于3%。个别非编码区差异较大，如着丝粒区,4、转录图谱（表达图谱、基因图谱）1）概念：表示基因的结构、位置和功能的图。是测定可表达片段（EST)的标记图。是在序列图谱的测定过程中完成的。基因组中97%的序列不转录，3%转录，特定组织中仅10%的基因表达2）作图方法：连锁分析关联分析：也叫等位基因关联、连锁不平衡。指同一染色体上位点间紧密连锁的基因，,在同一配子中某些等位基因的组合频率增加。如红绿色盲基因染色体畸变：体细胞杂交：计算机杂交：3）已获成绩：已获得160多万个EST的库，每天EST的增加速度为1000个。3.5万个基因已经定位。24条染色体先后被破译。最近被破译19染色体体上有1500个基因为含基因最多的染色体，占基因组的2%，13号染色体含1004个基因,染色体基因数目碱基数目(亿bp)国家13141+9912.23美英215472.37美国316001.99中国425851.86美国59231.94美国621901.66英国711501.53美国818871.46日本915751.091013571.32111524+7651.341214001.3113708+2960.95英国,染色体基因数目碱基数目(bp)国家1410500.88合作159450.82168800.98美国1715400.79美英183320.77英国1917820.60美国207270.60英国212840.34德日226790.34英美X11001.50Y780.50美国,2006年10月24条染色体上的基因数目全部确定,项目X染色体Y染色体大小1.50亿0.50亿基因数目110078同源数目5454基因功能决定人类存在决定人类性别进化程度保守毁灭性进化变异性变异性小变异性大对基因作用基因的良好处所基因的墓场回文序列少多,600万bp基因丢失可以补充无法补充基因作用睾丸抗原智力缺陷300多种疾决定雄性,3亿年前,Y与X染色体一样。为什么3亿年的进化使Y越来越小,基因越来越少？由于在男性性腺外露,易受外界环境影响经历的减数分裂次数比X染色体多350倍,而每次都是有变异风险的,从父亲传到儿子,Y染色体要有600个碱基的变化,所以Y染色体受的灾难比任何染色体都多。与X染色体的不交换,又导致基因的变化、丢失机会增大。有人估计,500万年后,地球上可能不存在男性,Y染色体会全成为垃圾.,最近的研究发现在Y染色体上存在许多回文序列,占Y染色体的10%，睾丸发育基因、精子产生基因位于此处。其上的基因在回文序列两端存在2个拷贝,可以自身交换、重组,或基因转变,用此方式进行基因的修复,因此认为500万年后不存在男性消失的问题有3500万碱基的序列不同个体存在伸展方向相反，可能是男性生殖能力和性格的控制区。女人超级生物女人性格多样化，耐受力强，抗性强感情丰富，心理复杂，坚强等多种优良特征，其原因就在于比男性多一条最不同寻常的X染色体，关键在于失活的那条X染色体上的15%的基因仍在活动,著名作家莎士比亚说：女人不仅同男人有天壤之别，女人们之间的区别也匪夷所思，女人啊，真是变幻莫测的生物4）转录图谱意义可以了解基因的精确位置和功能可以了解不同时间不同基因的表达情况可以了解不同组织中基因的表达情况可以了解正常情况与不正常情况下基因的表达情况与遗传图谱、物理图谱、序列图谱一起成为破译基因这部天书，了解生命的真谛的基石,五、中国人的工作:1、中国人作了哪些工作1）投入500万美金，在上海、北京成立了人类基因组南方研究中心、北方研究中心。6个月时间完成了其他参与国10年的工作量2）承担人类3号染色体测序，仅占整个基因组的1%。识别出122个基因，在已知的86个基因中，55个基因功能明确，8个与肾细胞癌、肌肉萎缩贫血等疾病有关在31个基因中找到75种不同的剪接方式，其中一个基因可以产生8种蛋白质，发现最大的基因88万bp,两个最小的基因。仅编码21个氨基酸和110个氨基酸、,3）建立了肿瘤、心血管病、神经、免疫、遗传性疾病材料收集网络。高血压家系200个，糖尿病家系88个4）建立了较完整的基因组研究体系。我国北京华大基因组研究中心每天可测序3000万bp，为世界上第六大基因测序中心，每天可测3千万bp5）疾病基因、功能基因研究。肝病相关基因、造血系统基因、肿瘤相关基因神经疾病相关基因等6）建立了生物信息和基因组信息库7）完成了一些模式生物的基因组计划。如：籼稻基因组：4.66亿bp,2、为什麽中国要加入人类基因组计划1)人类基因组计划需要中国（家系纯基因资源丰富）2)抢占科技平台，平分天下秋色。3)技术力量厚，有研究基础4)拥握科技、军事杀手剑5)重大事件的刺激1999年以前中国对虾患病毒病，大量死亡，为对付此种病毒要进行测序，由于国内作不了，180万美金委托国外做，又转让1/3知识产权。2003年在SARS面前中国科学家整体打了败仗，非典出现在中国，中国最早拿到病毒样品，但病毒序列却被外国人首先测序破译,六、人类基因组计划的意义1、是人类的第二张解剖图，在分子水平揭示人类的生、老、病、死之迷2、比较基因组结构，阐明生物的进化关系，揭示当代科学的第六大悬案人类进化的缺环。悬案1、宇宙生命何处觅悬案2、黑洞天体为何物悬案3、引力辐射问题悬案4、太阳系的第十个行星悬案5、新元素的发现。现有109号元素，但新修的元素周期表可容纳164号元素,悬案6、人类进化有缺环，即人类与猿之间的亲缘关系似乎还有一个中间过渡的生物类型，但至今没发现化石3、遗传