血流感染实验室诊断ppt课件

1、血流感染实验室诊断取得新进展，北京协和医院检验科王瑶于2013年4月13日2、内容、血流感染是什么？ 血流感染流行病学特征血培养过程优化阳性率分析减少培养结果污染分子生物学方法检测血流感染基于PCR的技术MALDI-TOFMSPNA-FISH，3，概念，感染=炎症病原体全身炎症反应综合征(SIRS )体温38c或90次/分呼吸频率20次/分钟或PaCO212109/感染l或10%脓毒血症(sepsis)=sirs，血培养为阳性或阴性的重度脓毒血症(severesepsis)=sepsis器官功能障碍，组织灌注不良和低血压感染性休克(septicshock )，4，概念，败血症(septicemia ) :病原菌及其毒素侵入血流病原菌主要是细菌，也是真菌、分枝杆菌等。 菌血症(bacteremia ) :细菌在血流中暂时出现的现象，一般无明显毒血症状，国外文献与败血症相通。 血流感染(bloodstreaminfection，BSI ) :败血症和菌血症目前统称为血流感染。5、血流感染、医院获得性血流感染原发血流感染实验室分离血流感染(laboratory-confirmeddbloodstreamidinfection，LCBI )临床血流感染(ClinicalSepsis )继发血流感染：血培养显着微生物，该微生物与其他部位院内感染有关不包括血管和血管内导管装置引起的血流感染。 社区获得性血流感染6、实验室证实血流感染(LCBI )，标准1 :从一次或多次血标本培养一致病原菌，培养的病原体与其他部位感染无关。 标准2 :患者至少发热(38c )、寒颤或低血压，疾病可以从1.2次以上不同部位的采血标本培养皮肤寄生菌(如白喉菌、芽孢杆菌、丙酸菌、凝固酶阴性葡萄球菌或微球菌)。 2 .至少从带血管内导管的患者血液标本中培养皮肤寄生菌群(如白喉菌、芽孢杆菌、丙酸菌、凝固酶阴性葡萄球菌和微球菌)，主管医师开始了适当的抗菌药物治疗。 3 .血中抗原检查阳性(流感菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、b群链球菌等)。 与实验室阳性结果一致的症状和体征与其他部位的感染无关。标准3 :年龄38c )、低温(37c )、呼吸暂停、脉搏缓慢，具有以下任一项(同上3点略)、7、临床血流感染(ClinicalSepsis )、其他未知原因致发热、血压过低(收缩压90mmHg或收缩压超过常规40mmHg 在具有这两个条件之一的少尿(每小时尿量不足30ml )等临床症状之一，未进行血液培养或呈血液培养阴性或血液抗原反应阴性的其他部位没有明显感染者的医生，对该感染中毒症状给予适当的抗菌药物治疗1岁以下的婴儿， 具有其他书籍以外原因引起的发热、体温下降、呼吸中止或心率下降等临床症状之一，且未进行血液培养或呈血液培养阴性或血液抗原反应阴性的其他部位无明显感染者的医生，对该感染中毒症状进行适当的抗菌药物治疗8， BSI流行病学特征、BSI发病率逐年增加，凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、真菌血流感染的发病率逐年上升革兰氏阴性菌的比例逐年在社区获得和医院获得的血流感染病原谱上存在差异的院内BSI患者病死率高，9、美国脓毒血症流行病学、Martinetal 348:1546，10，加拿大CANWORD监测2002-2009，DiagMicrobioloInfectDis.2011； 69:307，11，加拿大CANWORD监测2002-2009，DiagMicrobioloInfectDis.2011； 69:307，12，美国49家医院BSI病原谱，cid.2004，39336009-317，13，PUMCH2012年834血培养分离株，14，PUMCH2012年144株BSI大肠埃希菌药敏结果，ESBL60.2% 15 PUMCH2012年67株BSI肺炎克雷伯菌药敏结果ESBL34.4%、16，PUMCH2012年61株BSI鲍曼不动杆菌药敏结果17，PUMCH2012年76株BSI金黄色葡萄球菌药敏结果18， PUMCH2012年46株BSI草绿色溶血链球菌药敏结果表明： 19 2011CHIF-NET489株BSI酵母菌、20，2011 chif-net念珠菌对氟康唑的敏感性、21，2011 chif-net念珠菌对氟康唑的敏感性、22， 2011chif-net其他酵母菌对氟康唑的敏感性，23，2011 chif-net其他酵母菌对氟康唑的敏感性，采血量是影响血液培养阳性率的独立因素，CLSIM47-A :每位患者23组血液培养(4060ml ) survivinsepsiscampaignguidelines (world wide ) :抗菌药物治疗前至少采取2组血培养英国NHS血培养标准：采取2组血培养，25采血量对血培养阳性率的影响，JCM2007，26， 采血量对血液培养阳性率的影响，j.clin.microbiol.2011，49 (12 ) :047，27，j.clin.microbiol.2011，49 (12 ) :047， rouineset mayo clinic :2 bactecaeruobicplousbotles1bactecanaerobiclyticbottle，采血量和阳性率，非条件病原菌，28， 可能是下列细菌阳性凝固酶阴性葡萄球菌菌芽孢杆菌多次血培养的条件致病菌，结合临床分析，血培养污染菌，29，非条件致病菌，MayoClinic，(p38Cor90/min； 呼吸20/min； 白细胞12or10%未成熟中性粒细胞32%患者1支以上CNS阳性，BSI68%，无污染12%(p0.001)sirs症状： BSI5%，污染29%(p30秒1%2%碘酊30秒或10%碘伏消毒60秒：从穿刺点消毒至外界圈， 直径3cm70%酒精脱碘一步葡萄糖酸氯己定30s或70%异丙醇消毒后自然干燥，不适用于2个月以内的新生儿。38、急诊血培养污染率与工作量有关，theuniversityoftmichiganheallthsystem急诊血培养大多由采血员采集，其次是护士和医生采血员：人=1:9， 重症区护士：人=2:3其他地区护士：人=1:4年患者量82521人，血培养者7586人11.4%中至少1条阳性，病原菌阳性率8.0%，污染率3.7%的多组培养患者阳性率7.4%，单组培养阳性率5.1%(p0.001 )， 污染率差异无显着性(2.2%vs.2.6% )，schuyylerhalverson etal.JCM.2013online，39，急救时间工作量，schuylerhalverson，et al.jcm.2013 online，40，繁忙时血液培养污染率增加OR=0.93、schuyylerhalverson、etal.JCM.2013online、41抗菌药物的治疗和血流感染死亡率、死亡率、Chest115(2):1999、42、血培养三级报告制度、血培养阳性、最终报告：革兰染色、接种培养、初步报告(直接药敏)、 鉴定株，电话报告，鉴定标准药敏，43，血培养结果报告对治疗的影响A=AppropriateTherapy (正确治疗) I=InappropriateTherapy (错误治疗)，clininfecdis 2433650584-602，1997，44 血流感染快速分子诊断在未受抗菌药物使用影响的血培养阳性后，分子诊断直接采用血样本进行分子诊断，但不能提供药敏结果45，血培养阳性瓶分子鉴定，AntigoneKotsaki，et al.experto pin.med.diagn.2012，6 (3) :209，46，阳性血液培养PCR检测PCR特异性检测病原特异性PCR特定耐药基因检测：葡萄球菌mecA， 肠球菌van细菌载量：肺炎链球菌自溶性a基因lytA拷贝数广谱检测： PCR扩增特定靶多态性分析测序后续基因检测种特异性real-timePCR，experto pin.med.diagn.20126(3) :209.curropininfectdr 24(2):37，47， qPCR检测血培养阳性瓶绿假单胞菌，Target:ecfXgene血培养系统： BacT/ALERT，87支FA，13支FN，涂层均采用G-b对照方法：氧化酶API20EDNA提取：0.5ml肉汁，离心后开裂液， 水煮法定量PCR :扩增： Oligonucleotideprimers基因特异性检测： fluorescent-labeledhybridizationprobes，152 BP fragment annalclinmicrobilantimicrob 2010，900 qPCR检测血液培养阳性瓶铜绿假单胞菌，33株pae，敏感性和特异性均为100%1株kpn pae，pae(20CFU/ml)kpn(108CFU/ml )，因此PCR(-)检出限： ATCC27853ecfX基因为TOP10E.coli， annalclinmicrobilantimicrob 2010，9333021，49， 阳性血培养PCR检测最常见病原体多重PCR电泳谱、ELISA杂交、多重real-timepcrhyplexbloodscreen (bag、Lich、Germany):多重PCRLISISA、 以4.5-6h的速度进行实时测试(mobi diag，Helsinki Finland :多实时PCR微阵列分析，检测多种病原和mecA，3h多实时PCR，expertopin.med.diagn.2012 ) .50，血培养阳性多实时PCR，NEWMICROBIOLOGICA，36 65-74，2013，51，血培养阳性多实时PCR，NEWMICROBIOLOGICA，36，65-74，2013，52， 血培养阳性-PNAFISH核酸荧光原位杂交，血培养阳性肉汁染色PNAFISH，革兰阴性菌：商品化试剂盒eco/kpn/paeEfa/其他肠球Sau/scnCal/cgl/其他念珠菌为Salmonellaspp.90minPNAFISH 763360476 j.clin.microbiol.2013，51 (4) :161 jclin microbiol.2009； 47:247，53，MALDI-TOFMS，基质辅助激光解析电离(MALDI )原理：将试料分散在基质分子中形成结晶后，直接注入试料，用激光照射结晶，基质吸收激光的大部分能量，将基质分子和试料得到的能量投影到气相中电离，将电荷基质在样品的离子形成过程中起到质子化或去质子化的作用，样品带有正电荷或负电荷，带有电荷的离子基质干扰被检分子质谱峰的大小和浓度的不同种类的分析物选择不同的基质，分别为54，MALDI-TOFMS，飞行时间(TOF ) 原理：离子源产生的离子在加速电场获得动能，进入高真空无电场飞行管在该管内飞行时，质量轻的离子飞行速度快，早到达检测器的质量重的离子飞行速度慢，落后于检测器。 因此，根据离子飞行时间与质量负荷比的平方根(m/z )成比例的关系，通过测定飞行时间来计算离子的分子量。 55、MALDI-TOFMS操作步骤： 56、MALDI-TOFMS快速鉴定阳性血培养，采用菌落、阳性血培养肉汤快速鉴定： 20分钟(从报警到鉴定结果) maldi-to FMS (bruker ) BC tec (BD ) :正确213种阴性菌(包括厌氧菌) (90.61% )、284/319阳性菌(89.02%)80.9%多种菌被正确鉴定，7株缓释链球菌被鉴定为SPN maldi-to FMS (bruker ) bact/alert (biome rieux ) :38个阳性瓶，正确率含厌氧菌) 15株多菌被鉴定：多用通用库鉴定，革兰染色后用阴性或阳性库分析，6株鉴定第二种菌，ClinMicrobiolInfect2010； 163336353631jclinmicrobiol2010； 48353535253525352535253525352535253卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡卡6 48:900.58、PCR/ESIMS、广谱PCR-ESIMS (电喷雾质量) 189阳性血培养和45阴性血培养，种子一致率98.7%6例采用spn标本法阴性提供定量结果评价病原体载重量假阴性率24% :几乎全部采用混合感染5-6h检测PCR敏感性和ESIMS特异性的结果可直接检测标本，无需培养，ProcNatlAcadSci.2005； 102:8012.59、血样分子检测、特异性、属特异性、广谱、多重PCR、微阵列分析血培养阴性苛性培养菌如Bartonellaspp .巴通体、Coxiellaburnetii伯氏焦