基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)

争花不待叶，密缀欲无条。傍沼人窥鉴，惊鱼水溅桥。,宋苏轼桃花,基因工程,淮阴师范学院杨文杰,生物技术专业核心课程,C用于基因转移的受体菌或细胞,A用于核酸操作的工具酶,B用于基因克隆的载体,4基因工程的基本条件,第二节基因工程的载体系统,一、克隆载体,(一)载体的功能及特征,载体:在基因克隆中携带外源基因进入受体细胞的基因工程“运载工具”称为载体。载体的化学本质是DNA。目前基因工程中使用的载体多为经过改造的质粒DNA。,载体的概念,载体应具备的基本特性：,1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)；2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点；3.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；4.具有较高的外源DNA的载装能力；5.具有合适的筛选标记。,(二)质粒载体(Plasmid),1.质粒的一般生物学特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；,质粒常见于原核细菌和真菌中；,绝大多数的质粒是DNA型的；,绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA；,质粒DNA的分子量范围：1-300kb。,2.质粒的分类,R质粒：通称抗药性因子，它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且能够将此抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。,F质粒：又叫F因子或性质粒，它们能使寄主染色体上的基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞。,Col质粒：即所谓产生大肠杆菌素因子，它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。,3.质粒的基本特性,（1）自主复制（2）不相容性（3）转移性（4）编码性状,（1）自主复制,质粒DNA上都含有一个复制起始区，控制着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一般一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。,不同质粒在宿主内复制的程度相差较大，体现在单个细胞内的质粒拷贝数上，最多的可高达700个/细胞，最低的在每个细胞中只维持有一个质粒分子。,ori,E.coliColE1plasmid,rop,（+）,Rop,RNAII,RNAI,3,5,5,3,拷贝数的控制机制质粒DNA复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,复制方向,按复制能力可将质粒分为两种类型：,严紧型（Stringentplasmid):低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3个质粒分子,松弛型（Relaxedplasmid):高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可含高达10-60个质粒分子,（2）质粒的不相容性,质粒的不相容性(Plasmidincom-patibility)：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，又称为不亲和性。这样的两种质粒称为不亲和质粒。,不相容性的质粒组成不相容性群,目前，在大肠杆菌质粒中至少已鉴定出了30个以上的不亲和群。,质粒的接合转移,接合型质粒:能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等；,（3）质粒的转移,非接合型质粒:不能在自然条件下独立地发生接合作用如Col、R的其它成员。,性须,质粒的迁移作用（Mobilization)：非接合型的质粒由于分子小，不足以编码全部转移体系所需要的基因，因而不能自我转移。但如果在其寄主细胞中存在着一种接合型的质粒，它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型的质粒引发的非接合型质粒的转移过程，如ColE1质粒。,质粒的迁移作用,（4）编码性状,野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。,物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物；,物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱。,这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义。,4.质粒载体的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的。,pSC101：8.8kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因Tcr,ColE1：6.5kb，拷贝数20-30，大肠杆菌内毒素标记基因E1,RSF2124：ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因Apr,多克隆位点(MultipleCloningSites,MCS),现在几乎所有的载体都含有一个人工合成的密集排列的系列克隆位点，称为“多接头”、“限制酶切位点库”或“多克隆位点”。,在质粒载体内引入适宜的限制性核酸内切酶位点，以方便外源DNA片段的插入。,标记基因(MarkerGene),按其用途可将标记基因分为选择标记基因和筛选标记基因。,选择标记基因用于鉴别目标DNA(载体)的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来；,筛选标记基因可用于将携带了外源DNA片段的重组子挑选出来。,选择标记基因,1.氨苄青霉素抗性基因(Ampicillinresistancegene,ampr）,2.四环素抗性基因（Tetracyclineresistancegene,Tcr）,3.氯霉素抗性基因（chloramphenicolresistancegene,Cmr）,4.卡那霉素基因（Kanamycinresistancegene,Kanr）,筛选标记基因,筛选标记主要用来区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒，即重组质粒。,互补,lacZ,b-半乳糖苷酶的a-肽段,lacZ,b-半乳糖苷酶的b-肽段,b-半乳糖苷酶,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,5-溴-4-氯靛蓝,宿主细胞可编码LacZ酶C端部分序列。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫互补(-complement)。,在质粒载体上带有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码序列；,在这一编码区中插入有一个多克隆位点，它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到LacZ酶的氨基端，而不影响功能；,当外源片段插入到质粒的多克隆位点后，产生无互补能力的氨基端片段，因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。,由互补而产生的活性蛋白质在诱导物IPTG的存在下可与生色底物X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷）反应，因此Lac细菌在含X-gal和IPTG的培养基上可形成蓝色菌落，易于识别。,人工构建的质粒类型：,高拷贝质粒：突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩增基因；,低拷贝质粒：来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因；,温敏质粒：在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质；,测序质粒：含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker；,整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合；,穿梭质粒：由人工构建的具有两种不同复制起始点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。；,表达质粒：装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件；,探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选；,5.重要的大肠杆菌质粒载体,第一阶段：pSC101和ColE1应用较多，但相对分子量大且酶切位点少；,第二阶段：pBR322出现后，通过调整载体的结构，工作效率大大提高；pUC质粒去掉了多余的片段，添加了多克隆位点和筛选标记等；,第三阶段：在此基础上，又增加了辅助功能，形成了表达载体和穿梭质粒等功能性质粒。,pBR322：,4363bp；,松弛型复制，50-100拷贝/cell；,用于基因克隆,30多个单一位点；,具有Tcr和Apr；,pUC18/19：,分子量2686bp；,装有多克隆位点(MCS)；,正选择颜色标记lacZ；,用于基因克隆和测序。,Rop基因缺失，500-700拷贝/cell；,pGEM-3Z/4Z：,拷贝数2000-3000/cell,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记lacZ,装有两个噬菌体的强启动子,用于外源基因的高效表达,6.质粒DNA的分离与纯化,质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,质粒DNA纯度底、快速、操作简便,质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加CsCl和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取cccDNA,稀释沉淀cccDNA,在pH值在12.0-12.5之间时，线性染色体DNA片段会被变性，而闭合环状的质粒的DNA则不会被变性或只有少量的氢键断裂;当恢复中性pH值时便会迅速地复性。,但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。,用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体；,加溶菌酶裂解细菌细胞壁；,沸水浴40秒钟；,离心，用无菌牙签挑去沉淀物；,乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；,(三)噬菌体载体(Bacteriophage),1.噬菌体的一般生物学特征,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率、高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞；,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增；,大肠杆菌的噬菌体生物结构,噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体；,噬菌体由外壳包装蛋白和-DNA组成；,-DNA全长48502个核苷酸；,-DNA上至少有61个基因；,COS,COS,噬菌体生物学特性：感染周期,E.coli,吸附,注入,复制,包装,裂解,噬菌体生物学特性：感染周期,100个左右的拷贝,体内包装,包装范围为原DNA的75-105%,即36-51kb,噬菌体生物学特性：溶原状态,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态；,整合主要由-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质；,人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；,DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态。,2.-DNA载体的构建,缩短长度,野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。,因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。,根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体：,具有一个限制性内切酶位点。,具有成对的限制性内切酶位点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段取代。,插入型载体,插入位点,载体长度37kb,体外包装,插入片段,体外包装,插入片段大小：0-14kb,（5137Kb）,（5126Kb）,取代型载体,载体长度26kb,最小装载长度10kb,最大装载长度25kb,插入片段,插入片段,体外包装,体外包装,删除重复的酶切位点,野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个；,同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点；,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶切位点。,加装选择标记,与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此,加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容；,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,选择标记imm434,imm434基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物；,含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源DNA插入到标记基因中，基因失活，-重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑；,加装选择标记lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物；,当外源基因插入到lacZ基因中，基因失活，不能合成蓝色化合物；,而空载体-DNA则产生蓝色透明斑。,Spi-正选择型载体,若将外源DNA取代red和gam，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。,野生型的噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖(Spi+)，这种生长抑制表型受-DNA上的red和gam两个基因控制。,构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。,将野生型-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。,当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。,3.-DNA重组分子的体外包装,外源DNA插入到噬菌体载体后，需将重组DNA分子导入宿主细胞中。,转染的效率较低(105-106colony/ug-DNA)，重组DNA分子的转染效率更低(103-104colony/ug-DNA)；,采用体外包装技术，把重组DNA分子包装成成熟的噬菌体颗粒，便可按正常的噬菌体转导过程导入宿主细胞中，可明显提高噬菌体的转染效率，可达107左右。,-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞；,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行。,噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的，控制在野生型-DNA长度的75%-105%之间。在这一范围内的DNA可被包装成有活性的噬菌体颗粒，而超出了这个范围的就不能形成正常大小的噬菌斑。,包装限制说明噬菌体载体克隆外源DNA的能力不是无限的，有一个极限值。,噬菌体载体属于克隆载体，主要用于克隆DNA片段。构建cDNA文库和基因组文库,并从中筛选目标基因是噬菌体载体一般用途，也可用于亚克隆在大容量载体（如粘粒）中增殖的外源DNA片段。,4.用噬菌体进行克隆,在构建基因文库时，不同的重组噬菌体DNA经过裂解生长过程最终形成大量的噬菌斑。,这些噬菌斑的集合，就构成了基因文库。而质粒载体构建的文库是以菌落的形式存在的。,5.-DNA及其重组分子的分离纯化,6.-DNA作为载体的优点,2700个外壳蛋白分子,(四)大肠杆菌的M13单链噬菌体DNA,1.M13噬菌体的生物学特性,生物结构,+DNA,(+)DNA,RFDNA,II,V,感染周期,IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII,IIIVIIIVIIXVVIIIXVIII,lacZ,polylinker,2.M13噬菌体的构建,野生型M13RF-DNA,M13mpn系列载体,3.M13噬菌体的特点,(五)考斯质粒和噬菌粒,-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.5kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。,在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。,将噬菌体DNA与包装有关的序列和质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建考斯质粒和噬菌粒载体的思路。,1.考斯质粒(cosmid)载体的构建,考斯质粒是一类人工构建的含有-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体；,装载范围为31-45kb。,1978年Collins和Hohn发明构建1.8kb的-DNA片段+pBR322片段；,2.考斯质粒的特点,3.噬菌粒的特点（phagemidorphasmid）,噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。,pUC118pUC18+M13间隔区IG,pUC119pUC19+M13间隔区IG,500个拷贝,MCS,lacZ,lacI,ori,Apr,M13-IG,pUC118/1193200bp,重要的噬菌粒载体,pUC118/pUC119噬菌粒载体的优点：,具有小分子量的cccDNA，可克隆高达10kb的外源DNA片段，并易于进行体外分离与操作；编码有一个Ampr基因作选择标记，便于转化子的选择；拷贝数高，每个寄主细胞可高达500个；含有一个常用的多克隆位点，具有-互补；具有质粒与噬菌体的复制起始点；pUC118与pUC119的多克隆位点方向彼此相反，可用它们制备克隆基因的正或负链DNA；可直接对克隆的DNA进行测序分析。,pBluescript：体外转录载体,pBluescript=pUC+f1-ori+PT3+PT7,2958bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,f1-ori,pBluescript,PT3,ColE1-ori,pBluescriptphagemid的结构特征：,源生于pUC和M13载体在多克隆位点两侧存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向的指导外源DNA或基因的转录；同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，可按不同的复制形式合成出单链或双链DNA；含有一个Ampr基因作选择标记，便于转化子的选择；拷贝数高，每个寄主细胞可高达500个；含有一个常用的多克隆位点，具有-互补；可直链对克隆的DNA进行测序分析。,（六）人造染色体载体,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段,此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后,便形成重组人造染色体。,它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,1.细菌人造染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）,细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，其装载量范围在50-300kb之间；,各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝；,pBACs主要适用于：,2.酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）,YAC载体应含有下列元件：,酵母染色体的端粒序列；,酵母染色体的复制子；,酵母染色体的中心粒序列；,酵母系统的选择标记；,大肠杆菌的复制子；,大肠杆菌的选择标记；,YAC载体的装载量为350-400kb。,二、表达载体,在研究中经常需要获得大量蛋白质，以便深入开展下一步的工作。,通过生物化学手段提取和纯化蛋白是一件费时费力、而且效果欠佳的方法，甚至有时是不可能的。,在得到目的蛋白的编码基因后，使基因进行超量表达，能够高效分离纯化蛋白质，这样得到的蛋白质产物既可以满足精确的实验要求，也可以用于蛋白质产品的生产。,作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求。即能将外源基因运载到受体细胞中，其基本骨架是最简单的质粒克隆载体中的复制起点和抗生素抗性基因；,在基本骨架的基础上，增加表达元件，就构成来表达载体。,（一）启动子(Promoters),启动子本身并不控制基因活动，它就像“开关”一样，通过与RNA聚合酶及其他蛋白辅助因子等反式作用因子的相互作用,从而控制基因转录的起始时间和表达的程度。,启动子是RNA聚合酶能够识别并与之结合，从而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因上游；,启动子的筛选,Apr,ori,galK,pKO1,采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上；,受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质。,转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,启动子,A酶切开,Bal31酶解,目的基因,启动子的构建,T80A95t45A60A50T96,T82T84G78A65C54A45,启动子的可控性,P,乳糖启动子Plac的可控性：,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）,野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；,基底水平转录,诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高。,Plac,O,高效转录,葡萄糖代谢,野生型的Plac上游附近拥有代谢激活因子（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。,基底水平转录,葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，基因工程中使用的乳糖启动子均为抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5。,cAMP浓度降低,高效转录,乳糖启动子Plac的可控性：,色氨酸启动子Ptrp的可控性：,除去色氨酸,色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态；,在培养系统中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸(IAA),便可有效地解除阻遏抑制作用;,基底水平转录,在正常的细菌培养体系中,除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达。,色氨酸,高效转录,阻遏蛋白,高效转录,l噬菌体启动子PlL的可控性：,噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很难直接诱导控制。在基因工程中常使用温度敏感型的cI突变基因cI857控制PL。,cI857阻遏蛋在42时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达.,目的基因,阻遏作用,表达,色氨酸,但在大型细菌培养罐中迅速升温非常困难，因此常使用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达。,（二）终止子(terminator),1.强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物；,过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。,如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或DNA功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；,转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因本身的转录效率下降；,过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；,更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。,2.强终止子的选择与使用,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf；,pCP1,Apr,ori,Tcr,筛选Apr、Tcs的转化子,对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用；,终止子也可以象启动子那样，从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选。,终止子序列,P1,P2,（三）核糖体结合位点(ribosomebindingsite),外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS）,1.核糖体结合位点的四个特征结构要素结构,Shine-Dalgarno（SD）序列；,翻译起始密码子及其后续若干密码子；,SD序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成。,基因编码区5端若干密码子的碱基序列；,2.核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD序列的影响：,一般来说，mRNA与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于SD序列与16SrRNA的碱基互补性，其中以GGAG四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成C或T，均会导致翻译效率大幅度降低。,Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列5UAAGGAGG3，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3端区域3AUUCCUCC5并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译；,SD序列与起始密码子之间的序列的影响：,紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍。,SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。,SD序列与起始密码子之间的距离的影响：,SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。,在很多情况下,SD序列位于AUG之前大约7个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。,起始密码子及其后续若干密码子的影响：,大肠杆菌中的起始tRNA分子可以同时识别AUG、GUG和UUG三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。,除此之外，从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位；,目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的。,(四)密码子(codon),1.生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性。,生物基因组中的碱基含量：在富含AT的生物（如单链DNA噬菌体fX174）基因组中,密码子第三位上的U和A出现的频率较高;而在GC丰富的生物（如链霉菌）基因组中,第三位上含有G或C的简并密码子占90%以上的绝对优势。,密码子与反密码子相互作用的自由能：性中等强度规律,细胞内tRNA的含量,如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；,如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；,偏爱密码子的决定因素：,2.密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。,一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法。,外源基因全合成,对于那些含有不和谐密码子、种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关tRNA编码基因同步克隆表达的策略较为有利。,同步表达相关tRNA编码基因,为了提高人尿激酶原cDNA在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个tRNA编码基因克隆在另一个高效表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。,例如，在人尿激酶原cDNA的412个密码子中，共含有22个精氨酸密码子，其中7个AGG、2个AGA，而大肠杆菌受体细胞中tRNAAGG和tRNAAGA的丰度较低。,（五）质粒拷贝数,1.质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千