实时荧光PCR技术PPT课件

.1、实时荧光实时定量PCR的原理及应用)。2、讲座提纲，实时荧光定量聚合酶链反应的几种方法介绍，实时荧光定量聚合酶链反应的几种方法介绍，实时荧光定量聚合酶链反应的应用介绍，3、实时荧光定量聚合酶链反应的定义，在聚合酶链反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个聚合酶链反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。本发明的方法、方法、方法、方法、原理、原理、实时原理、常规的聚合酶链反应技术，对聚合酶链反应扩增反应终产物的定量和定性分析不能准确定量初始模板，也不能实时检测扩增反应。实时定量聚合酶链反应技术：利用荧光信号的变化，实时检测聚合酶链反应每个循环中扩增产物数量的变化，通过分析Ct值和标准曲线，对初始模板进行定量分析。5、实时荧光定量聚合酶链反应的定量原理，介绍三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值，如何量化初始模板？通过Ct值和标准曲线对初始模板进行定量分析。6、实时荧光定量PCR的原理扩增曲线，7、实时荧光定量聚合酶链反应原理-荧光阈值、荧光信号阈值：前15个周期信号作为荧光背景信号，即， 样品的荧光背景值和阴性对照的荧光阈值的默认设置是手动3-15个周期的荧光信号标准偏差的10倍：原则上应大于样品的荧光背景值和阴性对照的荧光最大值，同时应尽可能选择指数周期的初始阶段，回归系数大于0.99的实际信号：荧光信号应超过阈值。 实时荧光定量聚合酶链反应原理-Ct值，Ct值的定义：在聚合酶链反应扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定阈值时的扩增循环数，9，实时荧光定量聚合酶链反应原理-Ct值的可重复性，Ct值的特征：用同一模板扩增96次，终点的产物量不恒定；Ct值具有极高的重现性，10，实时荧光定量聚合酶链反应原理-定量原理，理想聚合酶链反应：X=X0*2n非理想聚合酶链反应：X=X0(1 Ex)nn:扩增反应的循环数X:第n个循环后的产物量X0:初始模板量Ex:扩增效率，11、实时荧光定量聚合酶链反应原理-标准曲线，模板DNA的量越多，荧光达到阈值的循环次数越少，即Ct值越小，对数浓度与循环次数的线性关系越好。标准曲线可以由具有已知初始拷贝数的标准物质制成。根据样品的Ct值，可以计算出样品中所含的模板量，12，未知样品的C(t)值可以确定，其初始量可以通过标准曲线由未知样品的C(t)值计算出来。实时荧光定量聚合酶链反应原理是绝对定量的，13、讲座提纲、实时荧光定量聚合酶链反应原理、实时荧光定量聚合酶链反应的几种方法、实时荧光定量聚合酶链反应的实验设计和应用、实时荧光定量聚合酶链反应原理、实时荧光定量聚合酶链反应的几种方法、实时荧光定量聚合酶链反应的实验设计和应用、非特异性荧光标记：1。SYBRGreen特异性荧光标记：2。TaqMan3。MolecularBeacon。实时荧光定量聚合酶链反应的原理荧光标记的脱氧核糖核酸产品。15，实时荧光定量PCR方法1-SYBR Green方法，SYBR Green，16，SYBRGreen方法的工作机理是SYBRGreen能与双链DNA的小凹槽结合。当SYBRGreen仅在与双链DNA结合后发出荧光并变性时，双链DNA分离并形成没有荧光的双链DNA(-di/dt)、TM、20、sybr green法解链曲线分析、21、循环数、sybr green定量原理，模板DNA的量越多，荧光达到结构域值的循环数越少，Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品的Ct值，可以计算出样品中所含模板的量，SYBRGreen的方法-建立聚合酶链反应，建立和优化反应系统：SYBRGreen的浓度：太高而不能抑制Taq酶的活性，太低，荧光信号太弱而不能检测引物：引物具有高特异性，否则在扩增中有一个异带，不允许定量的氯化镁浓度：可以降低到1.5毫摩尔，为了降低非特异性产物反应缓冲体系的优化反应温度和时间参数，由酶和其它参数与常规聚合酶链反应相同。23、SYBR Green法的适用范围，用于测定初始模板基因型的熔解曲线分析：可优化聚合酶链反应的反应条件，对常规聚合酶链反应如引物的评价具有指导意义；可以区分单引物、引物二聚体、变异产物和多产物。SYBR Green法、实时荧光定量PCR法2 - TaqMan法、TaqMan -水解杂交探针、报告分子标记探针、5端R探针、荧光猝灭剂标记探针、3端Q探针如FAM、维克等的优缺点。并且由R发出的荧光能量被Q基团吸收。无荧光，R与Q分离，荧光Taq酶具有53 核酸外切酶活性，可水解探针。26，TaqMan法的工作原理，每一个被放大的DNA分子都会释放出一个荧光信号，荧光可以在循环的任何一点被检测到，27，建立TaqMan聚合酶链反应，1，引物和探针设计：探针Tm为68-70，30bp，5不能有G，G可以淬灭荧光素，引物尽可能靠近探针，片段扩增400bp，引物Tm为59-602，反应参数的测定：一般为94，10-20.60， 30-60S(Taq酶53核酸外切酶活性在60时最高)或退火温度通过72、45、3的温度梯度来优化，并且引物和探针的浓度被优化：获得最小Ct值。 信号/背景比的最大引物浓度：50-900纳米探针浓度：50-250纳米4，其他与常规聚合酶链反应相同。28，TaqMan方法的优缺点，29、实时荧光定量聚合酶链反应方法3 - Molecularbeacon方法、荧光标记的发夹探针环和靶序列互补茎由互补配对序列组成。发夹杂交探针。工作原理，荧光共振能量转移(FRET)探针与DNA杂交时产生荧光变性过程：非特异性荧光延伸过程：无荧光退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号。分子生物学的应用范围，初始模板SNP(单核苷酸多态性)分析的定量基因型分析产品鉴定。32，分子信标的优缺点，介绍了实时荧光定量PCR的原理、实时荧光定量PCR的几种方法、实验设计和应用。实时荧光定量PCR的原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR的实验设计和应用。34，标准样品的实时荧光定量聚合酶链反应方法，内标内标法中的相对定量通常是看家基因如-肌动蛋白和GAPDH基因在细胞中的表达量或基因组中的拷贝数恒定。受环境因素影响，小的内标定量结果代表样品中包含的细胞或基因组的数量。绝对定量标准样品：已知拷贝数的质粒DNA。35，实时荧光定量聚合酶链反应标准样品的DNA拷贝数，如何设置用于生成标准曲线的样品？含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒含有与待测样品相同扩增片段的cDNA紫外分光光度计或荧光酶标记的分析浓度，根据质粒或cDNA的分子量将其转化为拷贝数，并进行连续稀释。36，实时荧光定量聚合酶链反应定量方法，绝对定量检测初始模板数的精确拷贝数，通常，标准曲线用于以相对定量的方式确定不同处理样品的靶转录物之间的基因表达差异(不同阶段)。37.实时荧光定量聚合酶链反应绝对定量方法，38。以实时荧光定量聚合酶链反应技术为例。采用TaqMan方法研究ERBB2在乳腺肿瘤组织样本中的表达差异。39、TaqMan方法被用作标记探针的例子。TaqMan探针用于双通道荧光定量，Fam标记的靶基因探针VIC标记的管家基因探针。40，TaqMan方法用于