实验九金免疫技术(精)PPT课件

(1)实验9金免疫分析，(2)实验目的：了解胶体金和免疫金的制备方法，了解蛋白质最佳标记量的确定，了解点金免疫渗滤试验和点金免疫层析试验的原理，掌握金免疫分析技术，(3)胶体金免疫渗滤试验和点金免疫层析试验的制备尿HCG测定-点金免疫层析试验，实验内容，(4)金免疫层析技术：以胶体金为标记物的免疫分析技术。胶体金：指将微小的金颗粒(1-100纳米)分散在溶液中形成的金溶液。它是金盐还原成原始金后形成的金颗粒悬浮液。用金溶胶蛋白(抗原、抗体或SPA、SPG)标记的胶体金具有高电子密度的特点，因此在金标记蛋白的抗原-抗体结合处显微镜下可以看到黑色颗粒。当这些标记物在标记物上大量聚集时，肉眼可见的红色或粉红色斑点可以显示在载体膜上，以便用于抗原-抗体物质的定位或表征。金免疫组织化学染色技术金(银)免疫光显微镜染色技术金免疫电镜染色技术金免疫分析技术点金免疫渗滤试验点金免疫层析试验第1部分胶体金和免疫金的制备1。胶体金的特性和制备1。结构：胶体金颗粒由基底金核(原子金金)和封闭的双离子层组成，附在金核表面的是内层负离子(AuCl2-)和外层离子层(H)，分散在胶体溶液中。形状：胶体金小颗粒(1-30纳米)为球形，胶体金大颗粒(30-100纳米)为椭圆形，胶体金双电层结构图。7，2。胶体金的一般性质稳定性：稳定、均匀、单一分散的悬浮液在液体中形成胶体金溶液。对电解质的敏感性：破坏胶体金的稳定性，导致分散的金颗粒聚集成大颗粒并从液体中沉淀出来。嘿。8、影响胶体金溶液稳定性的因素，1、胶体粒子之间的相互吸引。当胶体粒子靠得很近时，这种吸引力可能会导致胶体粒子合并得更大。2.水合层带电。溶胶的每一个胶体颗粒都带有相同的电荷。同性电荷相互排斥，双电层越厚，胶体粒子的电荷量越大，排斥力越大，越能防止胶体粒子的合并和聚结，溶胶越稳定。3.胶体界面溶剂膜。当一层厚的液体夹在两种固体之间时，这层液膜对两种固体的接近有排斥力。如果两个胶体粒子要进一步相互接近，就只能克服它们之间的溶剂化膜的排斥力。因此，溶剂膜的排斥力是稳定溶胶的原因之一。9，颜色和光吸收：通过改变柠檬酸钠的用量，可以制备不同尺寸的胶体金颗粒，制备具有四种颗粒尺寸的胶体金。10，3，胶体金的制备方法，原理：在一定浓度的金溶液中加入一定量的还原剂，使金离子变成金原子，形成金颗粒的悬浮液。常用还原剂：白磷、乙醇、柠檬酸钠、单宁酸等。方法：所有容器都应清洁，用酸或重铬酸钾洗液浸泡，并用双蒸水冲洗。氯化金溶液的制备：取1克氯化金，溶于100毫升双蒸水，制成1%水溶液。把它放在4英寸的冰箱里几个月到一年左右，它会保持稳定。取上述氯化金溶液，稀释100倍，得到0.01%氯化金溶液。加热至沸腾，加入适量柠檬酸三钠，搅拌，加热至沸腾(约2-3分钟*)，冷却，加入蒸馏水至原始体积*加入柠檬酸钠后，淡黄色的氯金酸水溶液变成灰色，变成黑色，然后逐渐稳定成红色。胶体金鉴定的主要检验指标包括粒径、粒径均匀性和有无凝集颗粒。小心o用肉眼、分光光度计、电子显微镜等方法观察时，液体应清澈透明。如果胶体金混浊或液体表面有漂浮物，则制备的胶体金具有更多聚集的颗粒。为了获得更均匀尺寸的胶体金颗粒，可以使用甘油或蔗糖密度梯度离心。胶体金可以在干净的玻璃器皿中保存很长时间。少量防腐剂(如0.02% NaN 3)有助于保存。胶体金制备注意事项(1)氯金酸易潮解，应保持干燥避光。(2)氯金酸对金属有很强的腐蚀性，因此不应使用金属勺称量氯金酸。(3)用双蒸水/三蒸水或优质去离子水制备胶体金。(4)玻璃容器必须绝对干净，最好是硅化的。免疫金免疫金的制备是指胶体金与抗原或抗体的结合，在免疫组织化学技术中通常称为金探针。制备方法：1。胶体金溶液的酸碱度调节。蛋白质3最佳标记量的确定。标签流程4。离心除去未结合的蛋白质，重复洗涤2-4次。免疫金最后制成工作浓度储存，17。1.胶体金溶液的酸碱度调节，用0.1摩尔/LK2CO3或0.1摩尔/LHCL将酸碱度调节至选定值，待标记蛋白质的等电点原则上是选定的，但也有微碱性，通常最适酸碱度需要通过多次试验来调节。用酸碱度试纸调节时，金颗粒容易吸附在电极上而堵塞电极，因此金溶液的酸碱度不能用酸碱度电极直接测量。在测定或保存之前，应使用具有足够缓冲容量的缓冲溶液(如聚乙二醇20000溶液)稳定胶体金。蛋白质最佳标记量的确定：将一定量的待标记蛋白质经一系列稀释后加入到装有一定量胶体金的试管中，然后分别加入氯化钠溶液，混合均匀后静置数小时，对照管(无蛋白质)和人蛋白量不足的管的颜色会由红色变为蓝色；含有足够或更多蛋白质的试管保持红色，蛋白质含量最低的试管是稳定胶体金所需的最合适的标记量。标记所有胶体金溶液所需的蛋白质总量增加了10%-20%。由于蛋白质溶液含盐量高或形成聚合物，标记过程容易受到影响，所以最好在标记前用低浓度盐水透析蛋白质溶液数小时并高速离心除去聚合物。在标记过程中，将金溶胶调节至所需的酸碱度(0.1摩尔/LK2CO3或0.1摩尔/LHCl)，缓慢加入适量待标记的蛋白质溶液并搅拌。10分钟后，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白和胶体金的聚集和沉淀。5%的BSA通常用于使其最终浓度为1%，或者将1%的聚乙二醇添加到总标记量的10%；离心30 60分钟(不同的胶体颗粒导致不同的离心条件)。沉淀物悬浮在含有0.2 0.5毫克/毫升聚乙二醇20000的缓冲液中。胶体金标记蛋白的纯化，首先低速离心，弃去聚集的胶体金颗粒，一般在5纳米离心20分钟；以9000转/分的速度；以2000转/分的速度离心20纳米20分钟；高速离心：5纳米胶体金结合物，60000克，4离心1小时；20-40nm胶体金偶联物，14000g，4离心1h；小心地吸出上清液，用0.01摩尔/升含1%牛血清白蛋白和pH7.6PB的0.01摩尔/升沉淀至原始量。平衡过夜后，重复上述两次离心，最后用0.01摩尔/升1%牛血清白蛋白和pH7.6PB(0.02%NaN3)悬浮至原始量的1/10，分装并在4储存。组合物中50%的甘油可在-18下储存一年以上。免疫金化合物最后用稀释剂制成工作浓度保存液。稀释剂通常是加入稳定剂的缓冲剂。稳定剂：蛋白质(小牛血清、牛血清白蛋白等。)、葡聚糖、聚乙二醇2000、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶等。聚乙二醇和牛血清白蛋白是最常用的。缓冲：铅、铅锑合金、钛等。稳定剂的作用：保护胶体金的稳定性，便于长期储存；防止免疫金的非特异性吸附反应。首先，DIGFA (1)原理将抗原或抗体点应用到固相载体的纳米滤膜上，并将制备的涂层微孔滤膜附着到吸水材料上。依次滴在膜上的样品、免疫金、洗涤液等液体迅速渗入吸水材料，最后阳性反应在膜上出现红点。特点：快速、简单、经济、无需特殊设备，已成为床边检测的主要方法之一。POCT(护理点测试)被定义为“在患者医疗场所进行任何医疗措施所需的检查”。不是在中心实验室而是在患者旁边进行的测试结果可以改善患者的保健措施”和“由临床实验室制定但不是在实验室设施中对患者进行的测试不需要固定和特殊的场所。试剂盒和试剂盒将被携带或运输到患者身边，以便立即检查。”、24、(2)技术型，双抗体夹心法ab ag(标本)金标抗体，滴洗液洗涤，在膜中心形成红斑；间接法ag ab(标本)，滴洗液洗涤金标抗体，滴洗液洗涤，在膜中心形成红斑。25、DIGFA示意图、操作示意图、装置分解图、盖子、微孔膜、吸收垫、底部、26、点金免疫过滤试验、27，(3)技术要点：1。试剂盒由滴金反应板、塑料小盒、吸水垫、涂有抗原或抗体的硝酸纤维素膜、胶体金标记和洗涤液2组成。操作要点：将样品滴入孔中，等待完全渗透。胶体金标记的抗体滴入孔中，直到完全渗透。将洗涤液滴入孔中，直至完全渗透。膜中心的红色或粉红色斑点是阳性的。光点深度表示正强度。(1)原理是将胶体金标记技术和蛋白质色谱技术相结合，以微孔膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。在载体膜的毛细管作用下，滴在膜一端的样品液体移动到另一端，就像色谱一样。在移动过程中，被分析物与固定在载体膜上某一区域的抗体或抗原结合而固化，而不相关的物质则在该区域被分离，然后通过胶体金色带来判断检测结果。(2)技术型双抗体夹心法竞争法间接法。29、毛细管作用，即管内液面上升到管外上方的现象，毛细管插入非润湿液体，管内液体下降到管外下方。毛巾吸水，地下水沿土壤上升是毛细现象。将一滴银放在干净的玻璃板上。它可以滚动而不粘在玻璃板上。将一块干净的玻璃板浸入水银中并取出。水银不会附着在玻璃上。这种液体不粘附在固体表面的现象称为不渗透。汞是玻璃的非润湿液体。把一滴水放在干净的玻璃上，它会粘在玻璃板上形成一层薄薄的层。将一块干净的玻璃浸入水中，然后取出。玻璃表面会被水弄脏。这种液体附着在固体表面的现象称为渗透。对于玻璃来说，水是一种渗透液体。浸润液在小管内上升的现象和非浸润液在小管内下降的现象称为毛细现象。能产生明显毛细现象的管子叫做毛细管。.30，1，双抗体夹心法，A，G，T，C，B，A:滴样B:手持端，吸水纸G:金标记抗体(免疫原)T:包被抗体C:包被抗金标记抗体，31，2，竞争法，a，g，t，c，b，a:滴样b:手持端，吸水纸g:金标记抗体(免疫原)t:包被标准抗原c:包被抗抗体。32、3、间接法、窗、吸水材料、金标准抗人IgG、吸水材料、吸水材料、标本装载区和包被抗原。为了消除待测样品中非特异性免疫球蛋白和特异性免疫球蛋白之间的竞争，结合金标准抗人免疫球蛋白，常用待测抗体为“反向流动免疫层析”，即、标记线，、关闭检测盒，、液体流向，、33、临床应用和评价。1.操作简单快捷，操作人员无需技术培训，专用设备、试剂稳定，便于储存，尤其符合“床边检查”2。灵敏度低于酶标记法和酶发光免疫分析