圆二色谱CD原理

.,圆二色性光谱及其应用（CircularDichroism，CD）,.,光学活性分子对左、右圆偏光的吸收率的差值,.,1、自然光,光具有波、粒二象性，是横电磁波。只有横波才有偏振现象:光矢量的振动方向与光的传播方向垂直，在垂直于光传播方向的平面内,有不同的振动方向。电场矢量E和磁场矢量H互相垂直、位相相同。,.,由于感光作用都是E引起的，因而，将E作为光矢量。振动面：E与光传播方向组成的平面。,.,从统计规律上说，自然光的光振动:在垂直于光速的平面上遍布所有方向，沿各方向振动的光矢量呈对称分布,相应光矢量的振幅（光强度）相等。,.,（1）高亮度的点光源；（2）日光色。色温接近6000K；（3）在可见光区连续光谱；（4）高显色性，显色指数95；（5）在整个寿命期内维持光色特性；（6）高电弧稳定性；（7）热重启能力；（8）启动后即能达到接近最大光输出；（9）电弧光斑小、易聚光。,超高压短弧氙灯:在高压纯净氙气中放电发光。,.,自然光,平面偏振光,圆偏振光,样品,椭圆偏振光,.,双折射现象：一束光射入各向异性晶体后有两束折射光。尼科耳棱镜。,2、光的偏振,在生物样品中，肌肉纤维、骨骼和牙齿等具有各向异性，淀粉粒、染色体和纺锤体等具有双折射性，因此被用于组织细胞的化学研究。,.,.,o光和e光：频率相同、振动方向相互垂直、平面偏振光,.,自然光入射到某些晶体（电气石、硫酸金鸡钠碱晶体等）时，晶片吸收振动面与晶轴垂直的光，而只允许振动面平行于晶轴的光通过。,.,自然光,平面偏振光,.,也称线（完全）偏振光，简称偏振光。它的振动面称为其偏振面。振动方向保持不变振幅发生周期性变化E之端点在空间的轨迹为一平面正弦曲线投影到垂直于光传播方向的平面上为一直线段,3、平面偏振光（Planepolarizedlight）,.,4、布儒斯特角,当入射光射到两种介质界面上时，反射光和折射光的偏振情况与入射光不同。,.,5、四分之一波片,使o光和e光的光程相差1/4波长的晶片。此时，相位差为/2，透射的合成光是长轴与晶轴重叠的正椭圆偏振光。,.,朝光源看，电场矢量方向按顺时针方向旋转的，称为右圆偏振光；电场矢量方向按逆时针方向旋转的，称为左圆偏振光。,若入射平面偏振光的电矢量与晶体晶轴的夹角45，则Eo=Ee，合成光是圆偏振光（Circularpolarizedlight）。,.,6、光的叠加,一束自然光可以看作是两束相互垂直而没有相位关系的平面偏振光的加和。,.,.,振幅相等、振动方向相互垂直、相位相差1/4波长的两平面偏振光合成圆偏振光,右旋,.,7、旋光色散（Opticalrotatorydispersion，ORD）,旋光性：光学活性分子对左、右圆偏光的折射率不同，透射光虽然仍然为平面偏振光，但其偏振面旋转了一定的角度。旋光物质又称为光学活性物质。旋光度：偏振面旋转的角度,旋光色散：不同波长的偏振光的旋转角度不同。旋光仪是测量旋光性与波长的函数关系，从而得到一个旋光色散谱。,.,圆双折射：某个物质对于左、右圆偏光的折射率分别为nL和nR，若nL=nR，则为光学各向同性物质；若nLnR，则为光学各向异性物质；左、右圆偏光的相位改变，若nLnR，透射光的偏振面右旋。若nLnR，透射光的偏振面左旋。,旋光现象是圆双折射的一种特殊形式。旋光物质使左、右圆偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光现象的产生是由于光学各向异性物质的折射率nLnR的结果。,.,旋光，双折射,.,化合物在正常情况下，处于低能的基态，电子占据所有的成键轨道（、n轨道）。如果电子吸收了外界的能量，它就从基态跃迁到激发态能级。如果所有的跃迁仅在基态的最低振动能级和第一激发态之间，吸收光谱将是很狭窄而不连续的谱线。由于分子的价电子跃迁总伴随着振动和转动能级的跃迁，所以，紫外分光光度计测定物质的吸收光谱，虽然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波长宽度并相对平滑的曲线。,8、光的吸收和圆二色性（circulardichroism,CD）,.,光的吸收,若溶液中的溶质对某一波长的入射光有吸收，则透射光的光强度小于入射光。,.,圆二色性的存在将通过该物质传播的左、右圆偏光变成椭圆偏振光。并且只在发生吸收的波长处才能观察到。,.,理论计算的圆二色性与该椭圆偏振光的摩尔椭圆率的关系：,=100/（cl）=3300（L-R）,：介质对圆偏振光的摩尔消光系数，c：样品摩尔浓度，l：样品厚度（cm），单位：/（molcm）或cm2/dmol。,.,圆二色性的表示,吸收（率）差=L-RA=ALAR椭圆度，摩尔椭圆度=2.303（ALAR）/4=3298（L-R）3300（L-R）在蛋白质研究中，常用平均残基摩尔椭圆度,.,园二色双折射,.,9、ORD与CD光谱,同时产生，包括同样的分子结构信息：光学活性物质分子中的不对称生色团。CD反映光与分子间能量的交换，旋光性则是与分子中电子的运动有关。可以由Kronig-Krammers转换方程相互转换。,.,CD谱的极值处与吸收峰一致（科顿效应，cottoneffect），因而分子中不同生色团对于谱的贡献比在ORD中更容易分辨。ORD是渐近线，两端不回归,.,CD比ORD容易辨别重叠峰,CD比ORD弱带易检测,CD比ORD更容易拟合,CD比ORD提供较多意义明确的信息,表明有三个生色团，其中两个有光学活性,.,CD能够提供的信息：,primarystructure,secondarystructuretertiarystructure,Alpha-helix,beta-sheet肽链骨架的构象变化,蛋白质的紫外吸收光谱主要有两个峰：190-250nm：肽键280-290nm：酪氨酸tyr，色氨酸trp,.,10、J-810圆二色光谱仪,S1-S2:第一级单色器；S2-S3:第二级单色器;M：球面反光镜；P：晶体石英棱镜；L:透镜；F:滤光器；,.,由CDM交互形成的左、右旋圆偏光通过光学活性物质，透射光强度随时间的变化,当调制电压过其峰值（正和负）时，RL时，透过的右旋圆偏光的光强对应于最大值，而左旋最小（实线）；RL时，透过的左旋圆偏光的光强对应于最大值，而右旋最小（虚线）。PMT的输出信号由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所组成。,.,圆二色光谱仪工作原理,用相同强度，相同频率的左、右旋圆偏光交替照射样品测得透过样品后的强度IR和IL,由于IR和IL十分接近，令IA=（IL+IR）/2，S=IRIL,只放大相应于S的PMT输出电压Es（交流信号），而不放大相应IA的输出电压EA。（适当选取放大倍数G值，使ESG与EA可比）。,.,PeltierCellHolder,CD/TotalFluorescence,FMO,StoppedFlow,-20200,.,Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive,蛋白质的光学活性,.,1、氨基酸的圆二色性,可见光区：各种氨基酸都没有光吸收。紫外光区：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子内的紫外生色基团：吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键、咪唑基和羧基等。,.,2、肽的圆二色谱,活性肽构象与其生理功能的关系肽的构象也是蛋白质构象的一种模型。肽的圆二色性为研究肽在溶液中的构象提供了重要信息。,.,Far-UV(250-170nm)SecondaryStructure:-helix,-sheet,-turn,randomTertiaryStructureClass:all-,+,/,all-I,all-IINear-UV(320-250nm)：aromaticsidechainNear-UVNear-infrared(300-1000nm)：coloredproteins,.,苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（tyrosine，Tyr）：277nm左右；色氨酸（tryptophan，Trp）：279、284和291nm附近；二硫键的变化反映在整个近紫外区。,芳香氨基酸残基及二硫键处于不对称微环境时，在近紫外区表现出CD信号,.,FarUVCDspectraofpoly-L-Lys,1、100%-螺旋2、100%-折叠3、100%无规卷曲,.,MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures,.,3、估算蛋白质二级结构含量,仅适合含量较高的蛋白质！,将测得的CD曲线与标准曲线拟合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改变xa、xb和xc，使qt与样本曲线最佳拟合（最小二乘法，leastsquaresminimization）,未知结构的蛋白的CD信号,.,myoglobin,qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwithxa=80%xb=0%xc=20%agreeswellwithstructure78%helix,22%coilForfurtherdetails:/cd/cdtutorial.htm,.,GCN4-p1,0oC：100%helix75oC：0%helixwhatabout50oC?qt=xoqo+x75q75fitsbestwithxo=50%x75=50%Showsthatat50oC1/2ofpeptidea-helixdimer1/2ofpeptiderandomcoilmonomer,.,Lau,TanejaandHodges(1984)J.Biol.Chem.259:13253-13261,螺旋二聚体分解为单螺旋,三氟乙醇（trifluoroethanol，TFE）诱导肽链形成螺旋,TFE对卷曲螺旋（coiled-coil）的影响,.,chymotrypsin(allb)lysozyme(a+b)triosephosphateisomerase(a/b)myoglobin(alla),CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructure,.,.,pH变化引起的肌球素变性前后CD谱的动力学变化,.,稀释前后的荧光和CD谱从伸展到折叠,螺旋含量的变化的动力学检测,KineticTraceat222nm(secondarystructureregion),.,Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion),细胞色素c伸展和折叠状态的CD和荧光光谱反映了芳环侧链（色氨酸残基）的变化,盐酸胍中的细胞色素c(伸展状态)与PBS混合后的CD和荧光光谱,.,6、磁圆二色谱（MagneticCircularDichroism，MCD）,磁性材料对左、右圆偏光的吸收不同而产生的二色性现象。利用法拉第效应，在外加磁场的作用下，许多原来没有光学活性的物质也具有了光学活性，原来可测得CD谱的，在磁场中CD信号可增大几个数量级。7000Gauss,.,实验要点,.,Sampleconcentration,AgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra.CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0.6to1.2.Itsusuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O.D.,.,样品杯：高度均匀的熔融石英，不会带来附加的圆二色性。光程：0.01cm-1cm，为了降低溶剂影响，一般提高样品浓度，用短光程。,cellpathlength,.,Nitrogenflushing,Flushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairitlldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation,.,HTplot,TheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.,.,.,Bandwidth(SBW)selection,Settingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial,.,标准操作时谱带宽度选为1nm；高分辨率测量用较窄的狭缝宽度，此时PMT电压较高，信噪比差；当样品的光密度很高、CD很小时，就要保持测试CD峰多需要的足够浓度，并用较宽的狭缝宽度。此时，由于样品OD值过高，可能存在有荧光或杂散光引起的某些假象。,.,Numberofdatapoint,datapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,itsadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithm,.,Accumulation,anotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations.Averagingisveryeffectivesinceitcompensatesshorttermrandomnoise,butitllnotcompensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin).Soiflongaccumu