基因诊断常用技术.ppt

基因检测常用技术,医学遗传学课程,检测技术的发展,1950s-RosalindFranklin(1920-1957)discoverchemicalstructureofDNA,startinganewbranchofscience-molecularbiology.,WatsonandCrickmadeamodeloftheDNAmoleculeandprovedthatgenesdetermineheredity.,1957-ArthurKornberg(1918-)oftheU.S.producedDNAinatesttube.,1966-TheGeneticcodewasdiscovered;scientistsarenowabletopredictcharacteristicsbystudyingDNA.Thisleadstogeneticengineering,geneticcounseling.,1972-PaulBerg(1926-)oftheU.S.producedthefirstrecombinantDNAmolecule.,1983-Dr.KaryMullisdiscoveredthePCRprocedure,forwhichhewasawardedtheNobelprize.,2000-J.CraigVentor,alongwithFrancisCollins,jointlyannouncethesequencingoftheentirehumangenome,基因组DNA的基本结构与化学组成,1核苷酸=1磷酸+1五碳糖+1碱基核酸分两类DNA:碱基A,G,C,TRNA:碱基A,G,C,U,双螺旋结构：是由2条平行的多核苷酸围绕同一中心轴构成的。多核苷酸的方向是由核苷酸的磷酸二酯键的走向决定，一条从53，另一条从35，两条链呈反向平行排列，彼此由氢键相连，G与C配对，A与T配对。,En,promoter,5,E1,GT,AG,1,5UT,3,3UT,人类结构基因包括4个区域：编码区：包括外显子、内含子前导区：编码区上游尾部区：编码区下游调控区：包括启动子、增强子等,基因的结构,E2,I2,转录起始点,终止密码,AATAAA,转录终止点,1ggggacagccagggacaggcagacatgcagccagggctccagggcctggacaggggctgc61caggccctgtgacaggaggaccccgagcccccggcccggggaggggccatggtgctgcct121gtccaacatgtcagccgaggtgcggctgaggcggctccagcagctggtgttggacccggg181cttcctggggctggagcccctgctcgaccttctcctgggcgtccaccaggagctgggcgc241ctccgaactggcccaggacaagtacgtggccgacttcttgcagtgggcggagcccatcgt,第一代诊断技术-限制性片段长度多态性检测（RFLP）,限制性核酸内切酶:识别和切割特异DNA序列；限制性位点,镰性细胞贫血,第一代诊断技术-Southern杂交,DNA-DNA杂交：,Southern杂交基本步骤,Deletion,第一代诊断技术-DNA体外扩增技术,聚合酶链反应（PCR）PCR的特点检材要求低操作简便灵敏度高特异性较好PCR的问题易污染定量困难人为因素影响,PCR技术出现的背景,1955年发现DNApolymeraseI；70年代的初期发现具有实验价值及可得性Klenowfragment1971年Dr.KjellKleppe提出类似基因修复复制的PCR原始雏形概念；1976年从热泉的细菌(ThermusAquaticus)中分离出能耐高温Taqpolymerase；1983年Dr.KaryB.Mullis发展出PCR技术，1985年正式发表了第一篇相关的论文。1989年，PCR被列为年度的重要科学发明产物。,PCR反应参数,预变性：94下预变性5-10min，使模板DNA完全解链。减少非特异性配对的引物与模板复合物形成。循环中的变性：一般变性温度与时间为941min。在变性温度下,双链DNA解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。扩增片段GC含量的差异是变性温度选定的主要依据，GC含量高则应相应提高变性温度，反之亦然，但一般不应低于90。应注意变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。,循环中的复性（退火）：PCR的一个关键参数，在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。如何解决这个矛盾？合理的退火温度从55到70。退火温度一般设定比引物的Tm4X（C+G）+2X（A+T）或软件计算低5,当产物中出现影响实验的非可异性扩增带时,以2为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。退火温度越高,所得产物的特异性越高。,当多重PCR扩增各引物对Tm值出现差异时，如何初步确定退火温度？一是将退火温度设定为比最低的Tm低5；二是根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。当退火温度较高以致接近延伸温度时，如何设定PCR参数？将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60和94)完成整个扩增循环,既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度，因此,循环中的延伸：延伸反应通常为72,接近于TaqDNA聚合酶的最适反应温度75.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为TaqDNA聚合酶的作用温度范围可从20-85.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,TaqDNA聚合酶每分钟约可合成1kb长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列,则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物,这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。,循环次数：循环次数主要取决于DNA浓度。一般而言25-30轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR产物中非特异性产物大量增加。如经25-30轮循环扩增后,产物量仍不够怎么办？一是增加模板量重新扩增；二是将扩增的DNA样品稀释103-105倍作为模板,重新加入各种反应底物进行扩增,这样经60轮循环后,扩增水平可达109-1010。,扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:CCo(1+P)n。其中：C为扩增产物量,C0为起始DNA量,P为增效率,n为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应？，减少非特异性产物。,PCR反应体系的组成与作用,引用分子克隆3提供的PCR标准反应条件：模板1pg-1g引物1mol/LDNA聚合酶15单位Mg21.5mmol/LdNTPs200mol/LeachKCl50mmol/L,模板,模板的质量是PCR成功的先决条件，PCR失败首先要考虑模板问题。所需的最佳模板量取决于基因组的大小：100ng到1g的人类基因组DNA，相当于3104到3105个分子，要保证模板中含有一个单拷贝，对于单拷贝基因,这需要0.1g的人基因组DNA。E.Coli10ng-100ng；LamadaDNA0.5ng-5ng；PlasmidDNA0.1ng-10ng。DNA样品中有多种污染物会抑制PCR，如SDS，在浓度低至0.01时就会抑制扩增反应。可以加入一些试剂,如Tween,Nonid,Trition之类的反过来抑制SDS。模板量过多则可能增加非特异性产物。模板DNA提取的方法较多，如酚-氯仿、盐析及固相吸附洗脱等。,引物,引物合成后通常以干粉形式运输，使用前需用TE或去离子水溶解，使其最终浓度为25-100M，以前者为佳，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。为保证引物的稳定性，应将干粉和溶解的引物储存在-20。以大于10M浓度溶于TE的引物在-20可以稳定保存6个月，但在室温（15到30）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20保存至少1年，在室温（15到30）最多可以保存2个月。,引物的浓度会影响特异性，最佳的引物浓度一般在0.1到0.5M。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。引物合成量一般以OD值为单位，如PCR工作量较小，如仅仅需要50-150个反应，只需订购1OD的引物，如超过200个反应，引物量应不少于2OD。,DNA聚合酶,考虑两个主要问题：成本与忠实性。最常用的是TaqDNA聚合酶，但因为其缺少3到5外切核酸酶（校正）活性，被看做是低忠实性的聚合酶。带有3到5外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实度，但价格昂贵，且大多无3端加A尾能力，不利于TA克隆。另外，一些高保真酶的效率要远远低于Taqpolymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些.反应体系中酶浓度过高会引起大量的非特异扩增，在常规PCR中一般控制在1-2U。,Mg2,镁离子浓度与酶活性密切相关。Mg离子的作用主要是dNTP-Mg与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，因此要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，200MdNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM，在多数情况下，较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。镁离子浓度过低则会明显降低PCR扩增效率。为了确定最佳浓度,可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中,应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团,例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质,以保证最适Mg2+浓度。,dNTPs,常规PCR扩增中dNTPs浓度是比较稳定的，变化较小，如每种dNTP的浓度为200M，高浓度的会对扩增反应起抑制作用。,如何提高PCR扩增特异性？,TouchDownPCR：在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5的退火温度下开始，然后每个循环降低1到2（当然，也可以每几个循环降12），直到退火温度低于Tm5。特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。945min/2cycles（9430s，6030s，721min）/2cycles（9430s，5930s，721min）/20cycles（9430s，5530s，721min）/725-10min/4保温,热启动：聚合酶在室温仍然有活性，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。方法一是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。二是使用蜡防护层将将反应成分物理地隔离开，在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。还有一种方法是使用抗体抑制失活的inactiveDNAPolymerase.当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。ampliwaxPCRGems(PerkinElmer)TaqBeadHotStartPolymerase(Promega)Magnesiumwaxbeads(Stratagene).,PCR增强剂：某些模板，尤其是高GC含量的模板，添加影响DNA熔解温度的增强剂可以提高产物特异性和产量。包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRxEnhancerSolution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。但为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度，尤其是会抑制TaqDNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。,dimethylsulfoxide(DMSO)upto10%formamideat5%trimethylammoniumchloride10-100uMdetergentssuchasTween200.1-2.5%polyethyleneglycol(PEG)60005-15%glycerol10-15%singlestrandedDNAbindingproteinsGene32protein1nME.colisingle-strandedDNAbindingprotein5uM7deaza-dGTP(forGCrich)150uMwith50uMdGTPTaqExtender(stratagene)PerfectMatchPCREnhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen),巢式PCR：使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。,PCR反应可能出现的问题及解决办法,不出现预想的扩增条带：模板：模板中含有Taq酶抑制剂，模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因为酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时PCR时忘了加Taq酶或电泳时忘了加溴化乙锭。,引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。,Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20l、30l、50l或100l，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20l后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败。物理原因：温度对PCR扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下PCR仪内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。,出现假阳性扩增：引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。除了酶及其他不耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样枪头均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。,出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次，是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶的量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时，重新设计引物。减低酶的量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸，也叫两步法)。,出现片状拖带或涂抹带：PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶的量过大或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶的量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。,PCR污染及解决对策,污染的预防：划分操作区：目前，普通PCR尚不能做到单人单管，实现完全闭管操作，但无论是否能够达到单人单管，均要求实验操作在三个不同的区域内进行，PCR的前处理和后处理要在不同的隔离区内进行：1.标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；3.产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备PCR扩增产物分析产物处理。切记：产物分析区的产物及器材不要拿到其他两个工作区。,分装试剂：PCR扩增所需要的试剂均应在装有紫外灯的超净工作台或负压工作台配制和分装。所有的加样器和吸头需固定放于其中，不能用来吸取扩增后的DNA和其他来源的DNA，1PCR用水应为高压的双蒸水；2引物和dNTP用高压的双蒸水在无PCR扩增产物区配制；3引物和dNTP应分装储存，分装时应标明时间，以备发生污染时查找原因。实验操作注意事项：尽管扩增序列的残留污染大部分是假阳性反应的原因，样品间的交叉污染也是原因之一。因此，不仅要在进行扩增反应是谨慎认真，在样品的收集、抽提和扩增的所有环节都应该注意。戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；,使用一次性吸头，严禁与PCR产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染；避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性；尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA的污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；重复实验，验证结果，慎下结论。,追踪污染源设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。如果以含靶序列的重组质粒为对照，100个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。阴性对照的选择亦要慎重，因为PCR敏感性极高，可以从其它方法（Sourthern印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。此外，每次扩增均应包括PCR体系中各试剂的时机对照，即包括PCR反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中PCR产物残留污染是非常有益的。如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。,环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。1.模板提取时真空抽干装置；2.凝胶电泳加样器；3.电泳装置；4.紫外分析仪；5.切胶用刀或手术刀片；6.离心机；7.冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等；此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源；2）0.1ml去离子水浸泡；3）取5ml做PCR实验；4）电泳检测结果。8.气溶胶。如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。,污染处理环境污染：1.稀酸处理法：对可疑器具用1mol/L盐酸擦拭或浸泡，使残余DNA脱嘌呤；2.紫外照射（UV）法：紫外波长（nm）一般选择254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，选择UV作为消除残留PCR产物污染时，要考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布，UV照射仅对500bp以上长片段有效，对短片段效果不大。UV照射时，PCR产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些二聚体可使延伸终止，但并不是DNA链中所有嘧啶均能形成二聚体，且UV照射还可使二聚体断裂。形成二聚体的程度取决于UV波长，嘧啶二聚体的类型及与二聚体位点相邻核苷酸的序列。在受照射的长DNA链上，形成二聚体缺陷的数量少于0.065/碱基，其他非二聚体的光照损伤（如环丁烷型嘧啶复合体，胸腺嘧啶乙二醇，DNA链间与链内的交联和DNA断裂等）均可终止TaqDNA聚合酶的延伸。这些位点的数量与二聚体位点相当。如果这些位点（0.13/碱基）在DNA分子上随机分布，一个500bp片段的DNA分子链上将有32处损伤位点，那么，105个这样的分子中每个分子中会至少有一处损伤。相反，如果100bp的片段，每条链上仅有6处损伤，105个拷贝分子中将有许多分子没有任何损伤。这就是UV照射有一定的片段长度限制的原因。,反应液污染：1.DNaseI法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5UDNaseI，室温反应30min后加热灭活，然后加入模板和Taq聚合酶进行正常PCR扩增。该方法的优点是不需要知道污染DNA的序列；2.内切酶法：选择识别4个碱基的内切酶（如MspI和TaqI等），可同时选择几种，以克服用一种酶只能识别特定序列的缺陷，室温作用1h后加热灭活进行PCR；紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液进行紫外照射，注意事项与方法同上述UV照射法；g射线辐射法：1.5kGy的辐射可完全破坏0.1ng基因组DNA，2.0kGy可破坏104拷贝的质粒分子，4.0kGy仍不影响PCR，但高于此限度会使PCR扩增效率下降。引物可受照射而不影响PCR，g射线是通过水的离子化产生自由基来破坏DNA的。,尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：原理：在PCR产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。在再次进行PCR扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。由于UNG在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。,dU引物法：合成引物时以dU代dT，这样PCR产物中仅5端带dU。UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。dU引物最好将dU设计在3端或近端。该法仅能用于引物以外试剂的处理。优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。,固相捕获法用于去除标本中污染的核酸和杂质，原理如下：1）用一生物素标记的单链RNA探针与待扩核酸杂交，杂交区域是非扩增区；2）用包被链霉亲和素的固相载体来捕获带有生物素探针的杂交核酸，通过漂洗可去除污染的扩增产物和杂质；3）洗脱靶分子后用特异引物扩增非RNA探针杂交区域。第2）步的漂洗后可用PCR检测以确定标本是否被扩增产物或重组质粒污染。RS-PCR法（RNA-specificPCR）也称为链特异性PCR，主要指用于RNA模板的特异性PCR法，该法可明显降低假阳性而不影响PCR的敏感性。其关键在于设计引物，逆转录引物的3端（A区）有20个核苷酸左右为模板的特异性互不序列，5端20个核苷酸（C区）为附加修饰碱基。与mRNA逆转录后，经超速离心使cDNA与多余引物分开，再用和第二引物（C）以第一链cDNA为模板合成第二链cDNA，以后的PCR循环中用逆转录引物的B区和引物C进行扩增加尾cDNA，而污染的DNA或质粒DNA才不会被扩增。,抗污染引物法该对引物扩增时通过病毒DNA克隆如入质粒的位点。这一区域只存在完整的原病毒中，在重组质粒中，这一区域分成两个区域与克隆位点被。如果重组质粒污染了标本，也不能扩增出任何条带，即使出现了扩增带，其大小也与预期的不同。只有原病毒DNA才能被引物扩增，因此只要出现预期大小的扩增带就可以证明标本是阳性的，该法试用于环状靶分子系列。,PCR引物设计的原则和要点,基本原则引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配),具体原则引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构（包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等）也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。避免3末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T,引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量不能相差太大引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm4(G+C)2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），而5端和中间G值相对较高的引物，因此设计5端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应,引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。引物的3末端形成的二聚体，应控制其G大于-5.0kcal/mol或少于三个连续的碱基互补对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点，当在引物5端添加酶切位点时要考虑：a)该目的序列内部不得含有相同的酶切位点，在引物发出后才发现错误的事情本人就干过，在论坛上也能看到这样的粗心人。这样的错误会给将来的克隆造成麻烦。b)如果打算PCR后直接酶切，不要忘了在酶切位点的外侧再加上保护碱基，不同的酶对于保护碱基的要求是不同的。如果不设计保护碱基，则多半要用TA克隆的方式连接到质粒上，这时要注意Taq酶的选择，这一点在后面再聊。若想在目的序列上附加上并不存在的序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。,一般说来，引物5端添加无关序列不会影响引物特异序列的退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对的碱基，可以在较低退火温度的条件下进行4到5个扩增循环；然后在假定引物5端序列已经加入到模板中，计算得出的退火温度下进行其余的循环。若在cDNA序列内找寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物和产物保持在mRNA的编码区域内，因为这是生成蛋白