ELISA实验、酶标仪、洗板机的原理和使用.ppt

ELISA实验、酶标仪、洗板机的原理和使用,酶标（ELISA）,ELISA是酶联接免疫吸附剂测定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的简称。以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。,1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断,ELISA是一种免疫测定。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。,1.ELISA的原理,ELISA技术原理,1.抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。2.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。3.酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4.受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。5.此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。6.加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。测定方法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水平），并且重复性好。,1.1抗原抗体反应,1.1.1可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb,抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=AgAbAgAb,AgAb的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3最适比例,1.1.4敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,2ELISA的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。,双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,样品（抗原）,酶标抗体,底物,酶标仪测定OD值,终止液,双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,3.ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；A（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；B（3）酶的底物；C（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液,3.1ELISA的试剂准备A,固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。洗涤液：在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,3.2ELISA的试剂准备B,结合物即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂1.酶的催化活性2.抗体（或抗原）的免疫活性3.含有或少含有游离的抗体（或抗原）4.结合物尚要有良好的稳定性。,酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。在ELISA中，HRP（辣根过氧化物酶），AP（碱性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。,结合物用的抗原和抗体制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.3试剂准备C酶的底物,E,3.3.1HRP的底物,HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,3.3.2AP的底物,3.3.3酶反应终止液常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,3.4对照设定,阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。,酶标基本步骤,用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为110gml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37孵育0.51小时，洗涤。4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml371030分钟。5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELX808酶标仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。,加样,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基本操作注意事项：,基本操作：加样；温育；洗涤；读板；,温育,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,洗涤,洗涤在ELISA过程中不是反应步骤，但却是决定实验成败的关键。目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质洗涤步骤：1.吸干孔内反应液；2.将洗涤液注满板孔；3.放置2min，略作摇动；4.吸干孔内液，也可倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤的次数一般为34次，有时甚至需洗56次。,洗板机,手工洗涤流速较难控制，步骤繁琐且耗费时间，目前市面上多种洗板机可供选择，其中以美国宝特的BIO-TEKELX50洗板机最为突出洗板机优势：自动化控制精确度高速度快（最快小于20S每板/每循环）,细胞包被层,ELx50洗涤速度可调、角度最佳,手工洗涤或一般机器洗涤角度不好，速度太快,洗板机使用注意事项,1、有一定地洗涤次数：多次洗涤有利于取得好的效果，一般不超过6次。2、注意每孔的加液量：以加满为宜，但不可溢出，一般为每控300微升。3、建议在洗涤前进行位置调节，吸针要到微孔底部，以降低残留量。因为一般ELISA实验洗涤结束后要求扣板，但此步骤在PCR-ELISA中易造成污染，故残留量应尽量减少。不能象一般ELISA操作一样用力扣板。4、建议用户采用两点吸液与底部冲洗方式，以得到好的洗涤效果。5、如果作PCR-ELISA液罐应加有1%次氯酸钠，加入的量不得少于产生废液的量。每天使用完毕后应用1%次氯酸钠冲洗管路及清洗头，然后用双蒸水冲洗管路。6、定期维护、检修仪器及配件。,洗板机的应用范围,所有涉及到96孔板换液、孵育、洗涤的实验：ELISA荧光ELISA细胞洗涤InCellWestern,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,比色/读板,将96孔板正确放入酶标比色仪中，以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（oplicaldensity，OD/吸光度（absorbence，A）表示，两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。,酶标仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。,美国宝特BioTekELX800全自动酶标仪,键盘格式,酶标仪的检测原理,酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。检测单位：光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。检测单位用OD值表示，OD是opticaldelnsity（光密度）的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度，OD1og（1trans），其中trans为检测物的透光值。在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。,酶标仪配件,光源：氙闪灯（波谱宽、低热辐射、寿命长，但是可见区能量低）卤素灯（不能用于紫外区，可见区能量强）,ELx800光源：卤钨灯光源,酶标仪配件,滤光片和单色器：滤光片和单色器各有优缺点，选择滤光片还是单色器和具体的实验要求有关。光吸收ELISA：单色器优于滤光片，由于卤素灯光强大，两者的灵敏度不相上下，单色器更为灵活、方便使用。荧光检测ELISA各有优缺点，单色器灵活，但是灵敏度低、特异性差；滤光片特异性好、灵敏度高，但灵活性不足。一般ELISA都是使用常用的荧光素，对科研工作者来讲滤光片较好。,ELx800标配滤光片405,450,490,630nm连续波长(采用单色器),MD公司：业界老大，产品质量过硬，做工精细。但对中国支持服务较差、管理混乱。BioTek公司：与MD公司伯仲之间，产品质量过硬，做工精细。进入中国市场十多年，市场占有率高，服务较好。PE公司：著名的分析仪器生产商，但酶标产品单一、简单，后续支持不足。Tecan公司:著名的液体分装设备生产商，高端产品较好，底端产品较差。,酶标仪生产厂家,Bio-tekELx800酶标仪的使用,1、先从试剂说明书上获得以下信息：（1）使用什么波长（2）如何判断结果。2、设置酶标仪上参数，即DE