蛋白质组学作业

文献9：蛋白质组学研究中传统中药公式茵陈蒿汤的保肝药与双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2-DE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)结合研究,2组,摘要：,茵陈蒿汤，一个著名的方剂，已被用于缓解各种类型的肝脏损伤。然而，茵陈蒿汤与肝损伤相关的药物靶点的机制在很大程度上是未知的。确定茵陈蒿汤可能的靶蛋白，双向电泳电泳（2-DE）为基础的蛋白质组学和蛋白进行治疗后，茵陈蒿汤MALDI-TOF/TOF-MS（飞行时间质量检测器）。有趣的是，15例调制蛋白被鉴定出7例发现是由茵陈蒿汤显著改变。茵陈蒿汤治疗引起显著的锌指蛋白407、触珠蛋白、巨球蛋白、1-抗胰蛋白酶显著下调；调节甲状腺素运载蛋白，维生素D结合蛋白和凝血因子，可能参与代谢，产生能量，分子伴侣，抗氧化作用、信号转导、蛋白质折叠和凋亡。最后，交互网络从7个差异表达蛋白的信号相关蛋白的生物信息学分析建立。值得注意的是，这些信号相关蛋白可通过直接相互作用或只有一个中间伙伴将7个蛋白质包含在网络中。功能途径分析表明，这些蛋白在蛋白质-蛋白质相互作用网络和多种重要的生理途径的调节。因此，我们的数据将有助于了解对茵陈蒿汤保肝作用的分子机制。,引言:,蛋白质组学分析已成功地应用于研究药物的分子效应，并获得有关其作用方式和治疗机制的信息。茵陈蒿汤，一个众所周知的方剂，由青蒿、栀子、埃利斯、大黄组成，是最重要和最广泛使用的中药在临床实践中对黄疸和肝障碍处理。它原是中国汉代的“伤寒论”记录（150公元215年），并被正式列入中国药典。值得注意的是，在文献中，各种各样的茵陈蒿汤的生物学效应已被描述，如治疗胆汁淤积，肝纤维化、肝炎、胆汁性肝硬化和胆汁淤积肝病。虽然这样的中药具有不同的药理作用，其保肝作用机制仍不清楚。因此，在本研究中，我们将使用蛋白质组学，以及探索目标研究茵陈蒿汤和影响的机制的计算方法，作为一个案例研究。利用双向电泳进行差异表达蛋白检测，然后MALDI-TOF/TOF-MS被确定，最后，利用生物信息学分析程序，验证茵陈蒿汤可能作用的直接目标。,材料与方法：,2.1。化学试剂聚丙烯酰胺凝胶制备的超纯试剂。18厘米的固相pH梯度（IPG）条IPG缓冲区二硫苏糖醇（DTT），PMSF，碘乙酰胺，尿素，硫脲，CCA，胰蛋白酶，3-（3-胆酰胺丙基）-丙磺酸钠溶（CHAPS）、甘氨酸、过硫酸铵（APS），三氟乙酸,材料与方法,2.2。茵陈蒿汤的制备植物原料来自于哈尔滨同仁堂药店购买（哈尔滨，中国）。所有药材的生药学研究室习俊望教授鉴定，黑龙江中医药大学。简而言之，茵陈蒿汤提取物由以下三提取的成分混合：茵陈蒿（12g)、栀子（9g)、大黄(9g)。根据伤寒论中茵陈蒿汤的制备方法，是在下面的程序编写。茵陈蒿（12克）煮1400毫升蒸馏水直到水的体积减少到约400毫升，9克栀子和9克大黄进行补充，并保持沸腾10分钟。提取液经5层纱布，浓度为1克每毫升粗药，最后溶液冷冻干燥。,材料与方法,2.3。动物处理和样品制备雄性Wistar大鼠（体重20020g）房间温度251C50，湿度5%。固定的12小时的光/暗周期，标准饮食和水。产生肝损伤病变的四氯化碳。动物随机分为对照组、模型组和茵陈蒿汤组每组8只。茵陈蒿汤用蒸馏水溶解，每天给药（250毫克/公斤口服）9天。从肝门静脉收集血液，并通过在4C，4500转5分钟离心分离得血清，使用前液氮冷冻储存在80C。,材料与方法,2.4。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2-DE）。血清中含30mMTris-HCl，7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，和40mMDTT，在这之后的裂解液于12000rpm离心60min4C.上清液沉淀用TCA沉淀法回收总蛋白，与干扰组分使用2-D清洁套件移除。每个样品的蛋白质浓度测定使用布拉德福德方法。总共有350毫克的蛋白质被加载到一个18厘米的线性IPG胶条,为第一向等电聚焦（IEF）。这条被放置到一个双向电泳细胞（Bio-Rad）和复水50V12h后的蛋白进行分离，基于PI根据以下协议：250V的线性爬60分钟，1000V快速爬了60分钟，10000伏线路AR爬5小时，和10000V快速爬升到60000的水平力。在IEF，IPG胶条进行平衡15分钟，在缓冲液中含有50mMTris-HCl，pH值8.8，30%甘油控制，7M尿素，2%SDS和DTT，1%；他们的毛皮类似缓冲疗法治疗（含4%乙）15min，直接应用到12%个均匀的SDS-PAGE凝胶电泳6h电泳使用千变万化的二西细胞系统（Bio-Rad）。每个实验一式三份。,2.5。图像分析凝胶使用生物银银染色加试剂盒（生物弧度）根据制造商的指示银染。银染色的凝胶进行扫描，利用GGS-800密度计（Bio-Rad）然后分析了使用pdquesttm软件（Bio-Rad）。LabScan软件（应用生物系统公司、福斯特城、CA）进行图像分析，包括背景摘要衍射光斑强度标定，现场检测，匹配。每个斑点的强度进行量化，通过计算后的凝胶图像的点体积已被归一化。每个样品是亲处理一式三份，以确保可重复性，与学生的t检验被用来评价蛋白质丰度对应每个靶点在凝胶的平均变化。蛋白质斑点超过一倍密度显著变化（P0.05）被认为是差异表达的和被选定为使用MALDI-TOF质谱鉴定,2.6。MALDI-TOF-MS和数据库搜索的蛋白质鉴定差异表达的蛋白点进行水平的兴趣从2-D凝胶与ExQuest点刀切除，洗3次蒸馏水，脱色15毫米铁氰化钾在50毫米硫代硫酸钠在室温为2分钟，离心脱水在乙腈和最后干燥状态，汽化器。孵育30分钟后，凝胶消化超过12小时，在37C肽提取两次用0.1%TFA（三氟乙酸）50%可以干下氮气保护。对于MALDI-TOF/TOFMS，肽混合0.5升的MALDI基质（5毫克/毫升-氰基-4-羟基肉桂酸稀释0.1%TFA和50%乙腈）和在MALDI样品板的斑点美国MS测量上具有延迟离子提取蛋白质分析仪进行。质谱分析的参数设置如下：加速电压20kV电网V；电压64.5%；延迟100纳秒；和激光脉冲数的50。MS/MS串联质谱精度校准，对m/z的MS/MS的碎片段，这是一个高峰，在肽质量指纹图谱（PMF）中比对。,用于定向采集数据的MALDI（基质辅助激光解析电离飞行质谱技术）设备是全自动的并且伴随这预定义探针运动模式和切换峰值强度阈从MS调查扫描到MS/MS，和从MS/MS到另外一个MS（串联式质谱法）。母离子满足预定标准，被选择去碰撞诱导解离质谱，用氩气作为碰撞气体和依赖+-5V滚动的碰撞能量直到从最强烈的高峰开始到探针模式的最后。内部校准使用两肽胰蛋白酶自溶产生的光谱。峰值匹配的参数如下：最小信噪比为20，质量容量是0.2道尔顿。匹配参考质量的最小峰值为4，最大异常值误差为50PPM。每个PMF谱和MS/MS的采集质量范围分别是900-3500道尔顿。基于胰蛋白酶的蛋白质鉴定片段的大小利用生物信息学数据库检索来对蛋白质鉴定。PMF在利用Mascot程序在SWISS-PROT数据库来检索。蛋白质的得分是10*log（P），其中P是概率所观察到的匹配是一个随机事件。错过的裂解位点允许高达1，得分均高于61被认为是显著的。,2.7.蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建及生物信息学分析蛋白双向电泳结合质谱鉴用来找到与茵陈蒿汤相关的可能的信号蛋白质。蛋白质-蛋白质相互作用网络从字符串的构建开始。字符串，一个元资源，聚集大部分蛋白质蛋白协会获得的信息，评分和权重，可以进一步探索药物靶标的关系网络，同时也在相关结合蛋白的环境中以不同方式结合了大量的数据库。要构建网络，从六个公开可用的数据库中获取蛋白质-蛋白质相互作用的信息，包括HPRD（人类蛋白质参考数据库）、MINT（分子间互作数据库）、DIP（蛋白质互作数据库）、MIPS（哺乳动物蛋白互作数据库）、IntAct（开源分子互作数据库）、biogrid（蛋白和基因分子间互作数据库）。最大的网络包括被构建的多数蛋白质。为更好的阐明，非关联的中介蛋白是从网络中删除了的和最小网络通过Steiner最小树算法优化了的蛋白质。这些蛋白质可以通过直接相互作用或者仅在蛋白质-蛋白质相互作用水平上的一个中间物连接在一起。,2.8网络分析所有的靶蛋白相互作用的合作伙伴是从字符串的数据库和网络与cytoscape2.8.2构建网络可视化三维分析软件。这个软件计算所有蛋白质对之间的最短路径。对于网络中的每个节点，网络分析仪计算它的程度，它的聚类系数，和其他各种参数。它寻找高凝聚力群体基本上是基于参数，最小尺寸，最小密度，边缘权重，合并和播种方法。每一级拓扑性质进行研究证明重要的节点/集线器发挥关键作用的功能途径。确定系数的值给出了变异能力的比例的数据集，这是拟合线性模型给出的。通过在支撑网络分析即中心性性能所做的网络拓扑分析，邻里关系性分布，平均聚类系数分布，拓扑系数。,结果与讨论,利用Cytoscape富集分析的可视化交互网络如图4所示。蛋白质与27个目标相互作用69相互作用。其中七个是显著的频率，并可能负责驱动的启动，进展，或维护疾病。锌指蛋白407有最高的相互作用，其次是甲状腺素运载蛋白、结合珠蛋白、凝血酶原1-抗胰蛋白酶、维生素D结合蛋白，和巨球蛋白。总共发现了20个可能的信号相关蛋白肝损伤状况。,结论:,本研究实现了蛋白质组学和生物信息学分析搜