人类染色体标本的制备及G显带核型分析

.人染色体标本的制备和g显带核型分析，安徽医科大学基础医学院生物学教室，目的和要求，1 .掌握染色体标本的制备方法和g显带技术。 2 .熟悉人外周血淋巴细胞的培养方法和具有g染色体的核型分析技术。实验原理染色体作为细胞遗传信息的载体出现在有丝分裂期。 用于制备人染色体标本的材料有骨髓细胞、外周血淋巴细胞、绒毛细胞、羊水细胞等。 其中最简便的是提取少量外周静脉血进行短期培养，经秋水仙碱处理(秋水仙碱阻断有丝分裂期细胞中微管的凝集，不能形成纺锤体，使有丝分裂停滞在中期时相，此时染色体具有最典型的形态)，再经低渗透、固定等处理，获得更多的中期分裂相进行核型分析染色体条纹是染色体标本经过特殊处理后，每条染色体沿纵轴有一定数量、着色程度不同的窄条纹。 染色体带是染色体固有的稳定特征。 染色体g的显带是多种显带技术之一，染色体标本经胰蛋白酶处理后用吉姆萨(maggimsa )染色液染色。 g显带技术因其方法简便，重现性好，带纹清晰，可长期保存，应用最广泛。 核型是指一个体细胞有丝分裂中期所有染色体，按大小、形态特征顺序排列构成的图像。 个体细胞含有两组相同的染色体，以2n表示。 染色体核型分析是细胞遗传学的重要研究手段，对临床多种疾病如染色体病、白血病、肿瘤等的诊断和研究具有重要意义。 人体细胞的正常核型，a组b组c组e组g组，亚中着丝染色体，中央着丝染色体，45，亚中着丝染色体，无随体，612，x，亚中着丝染色体，1315，近端着丝染色体，有随体，亚中着丝染色体，中央着丝染色体， 1920，中央着丝染色体，2122，y，有近位着丝染色体，随体，y染色体略大，臂平行伸展，无随体，基因组和核型，基因组：生物体内单体染色体组成称为生物体基因组(genome )，它是一个生物体染色体中累积的遗传信息显示染色体：321、1234，用特殊的染色方法使染色体沿其长轴显示明暗交替或浓淡不同的横条纹带。 正常男性： 46，XY，正常女性： 46，XX，正常人体细胞染色体带状示意图，实验用品)，1 .器具：采血器具，超清洁台，培养瓶，恒温水槽，恒温水槽锅，10ml尺寸离心管，低速离心机，量筒，载玻片，托盘天平，光学显微镜，染槽，电吹，酒精灯，剪刀，粘接2材料：人外周静脉血。 3 .试剂： RPMI-1640培养液、小牛血清、肝素、植物凝血酶(PHA )、秋水仙碱(20g/ml )、0.075mol/L氯化钾低渗透液、0.85%生理盐水、固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，现已配合)、玛格玛msa原液、0 .实验步骤，(1)制备人外周血染色体标本1 .取人外周静脉血1ml，与适量肝素快速混合抗凝。 2 .在超净化台内向RPMI-1640培养液中加入抗凝剂，每瓶加入0.30.5ml全血。 轻轻搅拌。 3.37恒温孵化器静置培养72小时左右(培养24小时后水平轻轻摇动培养瓶，悬浮血球)。 培养到6872h (即培养结束前的24h )，在1根中加入秋水仙碱(20g/ml )，最后变成0.10.2g/ml的浓度，轻轻摇动培养瓶混合，继续培养24h。 5 .停止培养，吹散培养物混合后，移至10ml玻璃离心管中，平整，1800rpm离心6min。 6 .低渗透上清。 加入37下预热的0.075mol/L氯化钾8ml，用吸管轻轻搅拌，37下低渗透处理20min。 7 .暂时固定新鲜调制的固定液1ml (甲醇：冰醋酸=3:1 )，轻轻混合，以1800rpm离心6min。8 .固定：丢弃上清液，加入上述新鲜固定液8ml，轻轻混合，室温下静置固定20min。 9 .扔掉上清液，重复固定一次。 10 .舍弃上清液，根据沉淀量加入适量滴数的新鲜固定液，轻轻混合，制成雾状悬浊液。 11 .制作人：取上述悬浊液中的12滴，滴入冰水或干燥的干净的载玻片中，吹走，通过火，空气干燥。 将12.37的烤箱在34天，或者在70下烤2h进行老化处理，备用于带分析。1、前处理：实验前3-4取健康小鼠，每只腹腔注射0.01%秋水仙碱0.3-0.4ml。 小心别伤害内脏。 2、取股骨：用一只手的拇指和食指按住鼠标头部，另一只手抓住尾巴，用力向后拉颈椎。 处刑后立即用剪刀剪断后腿毛皮，取出小鼠股骨，去除上面的肌肉，清洗。 (二)人染色体g带1 .胰蛋白酶的准备：在加入45ml0.85%生理盐水的染槽中加入0.25%胰蛋白酶溶液3ml，将pH调整至6.87.2，预热至37的恒温水浴锅。 2、胰蛋白酶消化处理：将经老化处理的样品片放入胰蛋白酶溶液中处理23min，轻轻摇动载玻片，保证作用均匀。 3 .漂洗：快速用0.85%生理盐水漂洗，停止胰蛋白酶的作用。 4 .染色：用吉姆萨工作液染色1015min。 5 .清洗干燥：用缓慢的自来水清洗载玻片，用空气干燥或吹气干燥。 6 .镜检：光学显微镜观察分析核型。(三) g显带核型分析1 .选择染色体分散良好、长度适中的染色体g显带核型照片，首先进行计数，剪切染色体。 2 .对：同源染色体形态相同，带状相同，非同源染色体的大小、形态等带状不同，但根据该原理，根据染色体的大小、形态、着丝粒的位置、随体的有无和g显带状等特征，46条染色体成为23对。 3 .染色体排列：将23对染色体按大小顺序排列，最后排列1对性染色体，将排列的23对染色体组粘贴到实验报告中。 这样，经过剪辑对的正常人体染色体图为正常人体核型图，可以写成46、XX或46、XY。 正常男染色体G-显带核型，人染色体G-显带特征口诀：秃头二蛇三蝶飘四鞭五黑腰六号，白脸七上八下九苗条十号长臂近十一低十三十五下，中上十六q二绞刑十七长臂带加脚十八人小腹十一点腰二十头重和脚轻的二十二人葫芦弹廿颅黑帽x一抬，y为黑脚。 注意事项、1 .染色体标本中低渗透时间很重要，处理时间过长会导致细胞膜早期破裂失去染色体，处理时间不足会使染色体分散变差，不利于计数分析。 2.G显带过程的重要因素是胰蛋白酶的作用时间、温度、pH等。 其中胰蛋白酶溶液应在37下充分预热，溶液pH值应维持在