第四章 酶联免疫测定法.ppt

第四章酶联免疫测定法,经典的化学分析方法（滴定分析、重量分析、简单的吸光光度法）是以简单离子或分子为检测对象的常量或微量分析，面对生物体系成分复杂且待测物浓度较低的测试条件则往往无能为力。,于是，一系列针对生物体系中化学成分的测量方法应运而生。免疫化学分析即其重要成员，它将免疫学知识与化学分析手段有机结合，为生命体系中高特异性、超微量的分析提供了解决方法。,基本概念：,抗原：抗原是指进入人或动物机体后，可刺激机体免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。抗体：是由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。,1.1抗原抗体反应的基本特性：,1.1.1可逆性,抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+AbAgAb,高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。,1.1.2特异性,抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。,1.1.3最适比例,1.1.4敏感性,化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。,第一章概述,1标记免疫技术：将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物（例如放射性核素、荧光素、酶等）进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，不必测定抗原抗体复合物本身，而是测定复合物中的标记物，这种免疫技术，称为标记免疫技术.2标记免疫技术的分类：按标记物分类：同位素标记荧光素酶标记等等,放射免疫技术,发光免疫技术,酶免疫技术,三大经典标记技术,三大经典标记技术,放射免疫技术,放射免疫技术是利用放射性核素的可探测的灵敏性、精确性，抗原抗体反应的特异性组合而创建的一类免疫测定技术医学生物学超微量分析的里程碑。放射免疫技术分为：放射免疫分析免疫放射分析,放射免疫分析的测定原理,Ag+AbAgAb+Ag（待测品）AgAb,R,R,将标记抗原（Ag*）和未标记抗原（Ag）与特异性抗体（Ab）相混合，结果形成标记的和未标记的抗原抗体复合物。标记和未标记的抗原竞争与抗体进行结合的现象，成为竞争性抑制作用。,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。,放射免疫技术的应用,放射免疫技术的特异性强、精密度好，灵敏度高（10-9-10-15g/L），对半抗原和抗原的测定及仪器设备条件要求不高，是基层医院测定超微量物质的主要手段，常用于各种激素、微量白蛋白、肿瘤标记物和药物等微量物质的检测。,放射免疫技术的缺陷,放射性核素半衰期短，试剂有效期短，通常为一个月。由于标记物的不断变化，使试剂批间、批内差异大，标准曲线无法保存备用。放射免疫使用放射性核素标记，需要一定的防护及废物处理措施。结果测定依靠时间的累计，至少每一样本一分钟。无法进行自动化分析,第二节酶联免疫法,免疫酶技术：酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。,一、酶免疫测定法的概念和分类把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。将酶与抗体或抗原用交联剂结合起来，形成酶标抗体或抗原。这种抗原或抗体与体内或者固相上的抗体或抗原特异性结合，加入相应的酶底物时，底物被酶催化生成有色产物，根据呈色深浅来判断待测抗原或抗体的活性和浓度。,酶免疫技术,酶免疫组化,酶免疫测定,均相,非均相,固相酶免疫测定,液相酶免疫测定,组织切片或其它标本中抗原的定位,液体标本中抗原或抗体的定性和定量,均相法：不需分离复合物与游离标记物即可直接测定的方法。异相法则需分离后测定,1971年瑞典学者Engvail和Perlmann,荷兰学者VanWeerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)。ELISA现在已成为目前分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术(immunoenzymatictechniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。,ELISA的基本原理和方法,ELISA的种类和变化,ELISA的特点,ELISA的应用实例,ELISA,ELISA的基本原理有三条：,（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。用于定量测定。,在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）,测定的对象可以是抗体也可以是抗原,标本,标本,酶标抗体,底物,显色有色为阳性,显色有色为阳性,酶标二抗,底物,测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应,结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比，因此可借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。其方法简单，方便迅速，特异性强。,ELISA的种类和变化,（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（假阴性）（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA,1.双抗体夹心法方法：用已知抗体包被，加入待测抗原，再加酶标抗体，加底物显色应用：这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等,ELISA检测抗原的方法,1、已知抗体包被于载体表面,3、加酶标抗体与抗原结合,4、加酶作用的底物产生颜色,2、加待检物抗原与抗体结合,4、加酶作用的底物不产生颜色,双抗体夹心法测抗原,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待检物无抗原与抗体结合,3、加酶标抗体无抗原结合,+,-,Y,Y,E,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,2.间接法方法用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人IgG（抗抗体或二抗）加底物显色。优点一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体应用常用于HCV抗体、HIV抗体和梅毒螺旋体抗体等的测定,ELISA检测抗体的方法,1、已知抗原吸附于载体表面,2、加待检物无抗体与抗原结合,3、加酶标抗Ig与抗体结合,4、加酶作用的底物产生颜色,1、已知抗体吸附于载体表面,2、加待检物有抗体与抗原结合,3、加酶标的抗Ig抗体,4、加酶作用的底物不产生颜色,间接法测抗体,-,Y,E,Y,+,包被固相载体:用已知抗原包被固相载体,加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体,加底物显色,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,竞争法方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包被物结合。加底物显色。应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等）,ELISA检测抗原的方法,竞争法测抗原,+,-,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,E,Y,2、加待检物抗原与酶标抗原竞争与抗体结合,3、加酶作用的底物不显色或显色弱,3、加酶作用的底物显色,1、已知抗体包被于载体表面,1、已知抗体包被于载体表面,2、加待测物和酶标抗原，酶标抗原与抗体结合,用已知特异性抗体包被固相载体,测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量,对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。,ELISA方法类型及应用,双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法，适用于检测两个以上抗原决定簇的多价抗原。间接法：是测定抗体最常用的方法。竞争法：可用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。,ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；,第四节ELISA的技术要点,固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面,(1)固相载体,要求,结合抗体或抗原的容量大抗体或抗原牢固地固定在其表面不影响免疫反应性利于反应充分进行固相方法简便易行，快速经济,种类,塑料制品微颗粒膜载体,固相载体,固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,3.1.2包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。,包被用抗原：天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。,封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附.常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。,酶免疫技术的核心组成部分,酶结合物（conjugate）酶标记物,通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的结合物,（2）酶标记抗体或抗原结合物,3.2结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂，对制备方法的要求：1酶的催化活性（不影响）2抗体（或抗原）的免疫活性3不含有或少含有游离的抗体（或抗原）4结合物尚要有良好的稳定性。,3.2.1结合物用的抗原和抗体,制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体。抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,3.2.2酶,纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。碱性磷酸酶，（AP），辣根过氧化物酶（HRP）另外尚有葡萄糖氧化酶，-半乳糖甙酶，糖化酶及乙酰胆碱酯酶等等。其中以前两种（AP和HRP）最为常用。,3.2.3结合物的制备,酶标记抗体的制备方法主要有两种，,（1）戊二醛交联法：（2）过碘酸氧化法(强氧化剂)：,戊二醛交联法,戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与HRP和蛋白质分子中的氨基结合。该法有一步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶标记物质量较均一。,过碘酸氧化法,纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度,常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化50%饱和硫酸铵沉淀提纯,酶标记抗体或抗原,（三）酶标抗体的鉴定1酶标抗体的活性鉴定一般以琼脂扩散和免疫电泳进行鉴定。2酶结合物的定量测定包括酶量、IgG含量、酶与IgG克分子比值以及结合率的测定。分光光度法P74,标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉,(3)酶和酶作用底物,酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应.,4对照设定,阳性对照品(positivecontrol)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。,二、反应条件的选择酶标抗体浓度：包被Ag或Ab浓度：棋盘滴定法3.温度、时间等,10g/ml1:10001.170.150.091:50000.460.0301:250000.12001g/ml1:100020.250.101:50000.910.120.011:250000.250.0100.1g/ml1:10000.420.130.131:50000.110.030.021:250000.0300,三、操作标准化1加样2保温3洗涤4比色,加样:,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基本操作注意事项,保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的