分子克隆技术实验指导

分子克隆技术分子克隆技术 DNA 重组技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆 （Molecular Cloning）或基因克隆，是在体外对 DNA 分子按照既定的目的进行 人工重组， 并导入到合适的受体细胞中， 使其在细胞中扩增和繁殖， 以获得 DNA 分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。 其基本原理是：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）经过特定限制 性酶切割以及与目标载体连接，组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环 状 DNA 分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质 粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质， 并且来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆， 而随质粒复制出的外源基因也就是 一个分子克隆。 分子克隆技术的成就对于工业、农牧业和医学产生深远影响，并将为解决世 界面临的能源、食品和环保三大危机开拓一条新的出路。 实验前准备实验前准备 实验开始前，需准备好所需的试剂，如 PCR 扩增及酶切，连接所需酶类试 剂及相应的 buffer，均为 TaKaRa 产品分装，Buffer、dNTP、引物试剂等需要从 -20取出至室温融化、涡旋震荡混匀离心后使用，酶类试剂从-20取出瞬时离 心（小于 4000 rpm）放置冰浴中备用。 还有各项实验所需的药品（如琼脂糖） ，以及配置好培养基，抽提质粒用的 溶液一、二、三等试剂。 本次实验所涉及的常规仪器及耗材有：Thermo Scientific Arktik PCR 仪，水 平电泳槽，超净工作台，恒温水浴锅，紫外照胶仪，赛默飞公司提供的 F1，F2 和 F3 一系列量程的单道移液器等仪器，1.5ml 离心管，玻璃试管，赛默飞公司 提供的 QSP 盒装吸头及 15ml 离心管等 。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先在 GenBank 中查询目的基 因序列，然后根据得到的序列进行酶切位点分析及引物的设计，通过 RT-PCR 获 取目的基因，酶切以及与载体连接，转化进入宿主菌中，针对得到的菌落进行菌 落 PCR 快速筛选，得到初步的阳性克隆，最后通过质粒提取及鉴定，得到的阳 性克隆，测序分析及得到正确的重组质粒。 GenBank 查询目的基因序列查询目的基因序列 打开NCBI主页， 在搜索栏中输入-Actin的登录号NM_007393， 点击search。 选择核酸数据库， 进入搜索结果界面， 可见 -Actin 的相关信息。 在 CDS 选项中， 找到编码区所在位置，-Actin 的 CDS 位点为 80-1207，点击复制编码序列，并 保存为.seq 格式。 根据根据 CDS 序列设计引物序列设计引物 打开 DNAstar 的 MapDraw 软件，点击 File，下拉菜单中打开 CDS.seq，点 击 ok 后可见 CDS 的酶切位点。点击工具栏中的 Map，选择 Absent Sites，可见 该片段所缺少的酶切位点。结合本次实验所用载体 pET-28 的图谱分析，确定上 游引物的酶切位点为 BamH，下游引物的酶切位点为 Hind。 打开 Primer Premier5 软件，点击 File，选择 New，DNA Sequence。在弹出 的 Gene Tank 窗口中，粘贴入 -Actin 的基因全长序列，选择 As is，ok 确定. 点击 Primer 进入 Primer Premier 窗口，点击 Search，在 Search Criteria 窗口 选择 PCR Primer，search type 选项中选择 Pairs。还可以设定搜索区域及产物长 度。由于 CDS 的位置是 80-1027，上游引物搜素区域为 1-80bp；下游则为 1027-1885bp；产物长度为 900-1300bp；引物长度一般为 18-30bp，无需修改。在 Search Parameters 里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认 即可，设置完毕后，点击 ok 开始搜索引物。 搜索结束后，在 Search Progress 窗口点击 ok。弹出 Search Result 窗口，搜 索结果默认按照评分（Rating）排序。点击其中任一个搜索结果，可以在“引物 窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置， 引物的各种信息等。 选择评分最高的引物，简单查看一下引物情况，避免出现一下情况：3不 要出现连续 3 个碱基相连的情况，比如 GGG 或 CCC，否则容易引起错配；Tm 应该在 5570 度之间， 上游引物和下游引物的 Tm值最好不要相差太多， 大概在 2 度以下较好；GC应该在 4555间。 选中上游引物，点击 Edit Primer。在引物编辑窗口的编辑栏中，5端添加入 BamH的序列（GGATCC）,点击 Analysis.根据结果添加合适的保护碱基。 再次分析后，点击 Primer。如符合条件，点击 OK，将编辑好的引物输送到序列 上。 同样的方法设置下游引物，在编辑栏中 5端添加入 Hind的序列 （AAGCTT）和保护碱基，注意：此时应该从 3端到 5端输入序列。分析好各 种参数后，点击 OK，接受引物。 最后在 Primer Primer 窗口查看该对引物的各种参数， 可用 BLAST 将设计好 的引物与 -Actin 序列进行比对分析。如果新引物参数不够理想，可重新选择符 合条件的另一对引物进行编辑及分析。 引物确定后，进行 Blast 分析，一般来说，都会找到一些其他基因的同源序 列，此时，只要没有交叉的其他基因的同源序列即可。 RT-PCR 获取目的基因获取目的基因 设计好引物后，通过 RT-PCR 钓取目的基因钓取目的基因 首先配制PCR体系， 在PCR管中加入2l 10 Taq buffer、 1.2l的25mM MgCl2、 0.2l 10mM dNTP、上下游引物各 0.3l、0.3lTaq 酶，经过反转录获得的 cDNA 模板 2l，最后加 RNA 酶纯水调整至 20l。 短暂混匀后，瞬时离心将所有溶液收集到管底。 PCR 反应是使用 Thermo Scientific Arktik PCR 仪进行扩增反应， PCR 仪程序 设置为 95 C 预变性 5 min， 95 C 变性 30s， 55 C 退火 40s， 然后 72 C 延伸 30s ， 72 C 2min, 扩增循环数为 28 个循环，最后在 12 C 保温。 注意，每对引物的退火温度不一样，实验前需进行反应条件的优化。延伸时 间需根据产物长度及 Taq 酶的扩增效率决定时间的长短。 程序设定好后，放入 PCR 管，盖上热盖，旋紧旋钮，点击 run 按钮，选择 设定好的程序，按 START 开始运行。 扩增结束后，取出 PCR 管，扩增产物于 1%的琼脂糖凝胶中进行电泳检测 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 制备1%琼脂糖凝胶， 在锥形瓶中加入0.3g的琼脂糖和30ml的TAE缓冲液， 加热时应盖上封口膜或保鲜膜， 以减少水份蒸发， 微波炉加热至琼脂糖全部融化。 待混合物冷却至 50-60时，将其倒入胶槽中。 待凝胶凝固后，轻轻拔去梳子，将胶放入电泳槽中，并倒入适量的 TAE 缓 冲液。假如适量的 6 Loading Buffer，混匀后即可上样。 分别将样品全部加到上样孔中，并点上 2l marker。 注意：上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 加样完成后，盖上电泳槽盖，90V 恒压电泳，指示剂迁移至凝胶的 2/3 处， 即可停止电泳。 取出凝胶，置于 EB 中浸泡 20min 后凝胶扫描仪下查看电泳结果。 胶回收及胶回收及 DNA 的纯化的纯化 在紫外下，将特异电泳带用刀尽可能切下放入到1.5ml的离心管中，称琼脂 糖带的重量。 在含琼脂糖带的离心管中分别加入相应比例体积的Buffer GM， 于55到65 水浴中温浴，每 2-3 min 摇动混合物至凝胶完全融化， 将离心柱装在收集管内，把获得的 DNA 熔胶液全部转移至离心柱中，静置 1min，12000rpm 室温离心 2min，弃收集管中的滤液，将离心柱套回收集管内。 若 DNA 凝胶溶液体积超过 700l，重复以上操作，将剩余 DNA 凝胶溶液转 移到离心柱中。 弃收集管中的滤液， 将离心柱套回收集管内。 加 700l 已含无水乙醇的 Buffer WB 至离心柱中。12000rpm 室温离心 2min。 注意：Buffer WB 在使用之前必须 确定是否已加入合适比例的无水乙醇。 重复用 700l Buffer WB 洗涤离心柱一次。最后弃收集管中的滤液后重新将 离心柱放回收集管内。室温下,12000rpm 离心 2 min 以除去离心柱基质上残余的 液体。 把离心柱装在一个干凈的 1.5ml 离心管上，加入 30l 的 Elution Buffer 到柱 基质上，室温放置 1min, 12000rpm 离心 1min 以洗脱 DNA。 回收得到的 DNA 溶液放在-20保存或直接进行下一步的酶切。 酶切目的基因和载体酶切目的基因和载体 酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套 Buffer。 在扩增产物组标记为 T， 载体组标记为 C 的 PCR 管中加入如下成分： 2l 10 x 酶切缓冲液，6l 的蒸馏水，BamH和 Hind 各 1l。T 组加入 PCR 扩增产物 10l，C 组加入 10lpET-28 载体 10l。混匀后，用微量离心机甩一下,使溶液集 中在管底，37 C 酶切 3-4h，酶切结束后，65 C 保温 5-10min 以终止酶切及防止 DNA 末端退火，取出后置冰浴骤冷，酶切产物可直接进行连接反应。 目的基因和载体连接反应目的基因和载体连接反应 连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。 在实验组标记为T的PCR管中加入4l DNA酶切产物， 1.5l pET-28a载体， 1l 10 x T4 连接 buffer，0.5l T4 DNA 连接酶，加水补足到 10l。在阴性对照组 标记为 C 的 PCR 管中加入 1.5l pET-28 载体，1l 10 x T4 连接 Buffer，0.5l T4 DNA 连接酶，加水补足到 10l。对于有效的连接体系来说合适的载体和目的基 因分子数比值控制在一定范围内是有必要的，这个比值为 1：3-1：10，较大的片 段可适当提高比值。连接时，PCR 产物浓度可以尽可能的大，轻混反应物，并 在 16连接 12-16h，也可以置于 4连接过夜。 转化及筛选转化及筛选 转化前，需进行大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备 接种 10l 大肠杆菌 DH5 甘油菌至含有 2ml LB 液体培养基的试管中， 37 每分钟180-200rpm振荡培养过夜。 以1%的接种量将甘油菌种20l接种到2ml LB 培养基中，37振荡培养，使菌液 OD 600 达到 0.30.4，此过程大约需要 3h。 菌液在 4 C 条件下，以 5000rpm 离心 2min，回收菌体； 在超净工作台里用枪头小心移去上清， 将菌体重新悬浮于 400l 预冷的 0.1M CaCl2溶液，重悬时操作要轻，加入适量无菌甘油，混匀，冰浴放置 20min，分 装制备得到的感受态置于-80 C 储存备用，也可将感受态置于冰上 12-24h 后，可 以直接进行转化。整个操作中细胞保持在冰冷的状态。 大肠杆菌的转化（热激法）大肠杆菌的转化（热激法） 将连接产物（实验组和阴性对照组）分别加入到制备好的感受态细胞里，用 移液器轻轻吸打混匀， 使连接产物质粒DNA与感受态细胞充分混合， 冰浴30min。 将管放入预加温到 42的水浴中热激 90s，将管转移到冰浴中，使细胞冷 却 1-2min。 分别加入到 1ml 无抗生素的 LB 液体培养基，37 C 振荡培养 0.5-1h； 500rpm 离心 2min， 在超净工作台中用枪头吸取 800l 上清弃掉， 保留 200l 悬浮菌体，将菌液倒入含卡那霉素的 LB 固体培养基表面，用无菌涂布棒涂布均 匀，注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 若平板内 液体已被吸收，倒置平皿，于 37培养，12-16h 后可出现菌落。次日，取出平 板观察，挑取阳性克隆进行菌落 PCR。 快速鉴定阳性重组子快速鉴定阳性重组子 在 PCR 管中加入 2l 10 PCR Buffer，1l dNTP mix ，2l 上游引物，2l 下游引物，1l Taq DNA 聚合酶，加水至 20l。如果样品数较多，即可先配置好 总体系进行分装，只需在体积数乘上样品数加 1 的总体系。 在划好区域的平板中，分别随机挑取一个转化子，用灭菌的小枪头挑取少量 菌体，先将小枪头放入装有含卡那霉素的 LB 培养基的 EP 管中洗涤 2-3 次，然 后将同一枪头浸入装有 PCR mixture 的 PCR 管中反复吹打以作扩增培养细菌用； 另取一 PCR 管，不加转化子模板，作为阴性对照。初步鉴定阳性重组子，一定 要做阴性对照 将以上 5 只 PCR 管轻微离心后，放入 PCR 仪，程序设定跟钓取目的基因一 致，只需调用相应的程序，按 Start 运行即可。 取少量 5l PCR 反应产物，1%琼脂糖电泳分析。紫外检测仪下观察，阳性 重组子能得到相应片段的 PCR 产物。 根据电泳检测结果，将上述操作中的洗涤过有菌枪头的离心管，转移到含 LB 液体培养基的试管中的，37 C 振荡培养过夜，得到的菌液用于质粒提取作进 一步的验证。 质粒提取及鉴定质粒提取及鉴定 取 1ml 菌液于 1.5ml 离心管中， 12000rpm 离心 1min， 弃上清， 若菌体较少， 再将剩余的菌液离心。将离心管倒置于吸水纸上数分钟，使弃尽残留培养基。 加入 100l 溶液，用枪头重悬菌体沉淀，重悬一定要充分均匀，不能 留有细菌团块。 加入新配制的溶液200l,立即吸打混匀 4-5 次，动作要轻柔。 加入 150l 溶液， 盖紧管口， 上下颠倒离心管 5-10 次， 静置 5min， 12000rpm 离心 5min 将上清转移到一新离心管中，注意不要将沉淀物吸起，再加入等体积酚氯 仿，充分混匀，12000rpm 室温离心 2min。 将上清移至另一新离心管中，加入两倍体积预冷的无水乙醇，混匀， 12000rpm 离心 5min。 弃上清，加入 1ml 70的乙醇，用枪头轻轻吹打洗涤沉淀，注意不要将沉淀 打碎或吸走。12000rpm 离心 5min，小心用弃去上清，注意不要将沉淀倒走 将离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。 用 20l 含 RNaseA 的无菌蒸馏水溶解提取物，室温放置，充分溶解 DNA。 溶解得到的质粒经过酶切鉴定后，送样测序分析，即可得到正确插入的重组 质粒，可以进行相关的研究。 实验结果与分析：实验结果与分析： 根据 PR-PCR 实验，扩增得到 1200bp 左右的目的片段，如图显示，利用相 应的酶切目的片段以及与 pET 载体的连接，进过菌落 PCR 的快速鉴定，有两个 重组子扩增片段很亮，取这两个重组子进行质粒提取检测，酶切检测如图，可清 楚的看到与目的大小一致的条带被切出来， 说明目的片段已经成功连入表达载体， 测序结果没有错配及移码， 结果如图， 表明得到了成功构建的 pET-Actin 质粒。 疑问与解答疑问与解答 Doctor A，实验做完了，结果也比较理想，但是有几个问题需要请教一下。 在 PCR 扩增过程中，退火时，为什么引物与模板杂交，而模板之间不复性？ Miss Q 你这个问题问得很好，很多人都不明白这个问题，之所以模板质检 不复性，是因为引物的量相对模板 DNA 来说要量大得多。其次就是模板 DNA 比引物分子量大且复杂，所以在复性的条件下，引物与模板在局部形成杂交链的 机会比模板复性要大得多，所以引物与模板可以杂交而模板之间则不能。 谢谢 Doctor A，PCR 扩增的时候，还会出现 PCR 扩增产物特异性不好或产 量过低这些情况，应如何调整反应体系或反应条件呢？ 这是个很常