一步法RT-PCR试剂盒使用说明书

北京厚生博泰科技有限公司beijinghooseebiotechnologyco公司一步RT-PCR检查套件(单步RT-PCR放大套件)(样本编号HS0612-2 )产品包装套件组成25次(HS0612-1 )100次(HS0612-2 )Super RT/Taq Mix25 ul25 ul2 rt-PCR缓冲器1.25 ml毫升2 1.25 ml毫升DEPC-ddH2O1毫升2毫升保存条件-20产品概要本试剂盒是为了一步RT-PCR实验而开发的，逆转录和PCR在同一反应体系下进行，反应中无需添加试剂，无需打开管盖，避免污染的同时提高了检测灵敏度和实验效率。 本试剂盒含有全新的高效逆转录酶、高速热启动DNA聚合酶，还含有适合逆转录和PCR扩增的反应缓冲液和实验所需的反应成分。 经过重组表达的SuperRT逆转录酶rnase的活性消失，逆转录反应中RNA的分解减少，容易得到全长的cDNA。 该反转酶的反转录效率高，能对少量的RNA模板进行良好的反转录反应。 SuperRT逆转录酶可通读与RNA亲和性高、GC含量高、二级结构复杂的RNA模板，获得高产cDNA。 用于PCR反应的DNA聚合酶具有扩增效率高、拉伸速度快的优良性能。 独特的缓冲系统能同时发挥逆转录酶和聚合酶的最大效果。 使用该试剂盒，可以在同一反应管内简单且迅速地进行逆转录和PCR扩增反应。 本试剂盒扩增的目标物3 的末端附有“a”碱，可直接用于T/A克隆。产品特点1、高效转录GC含量高、二级结构复杂的RNA模板。2 .耐热性和稳定性强。3 .操作简单快捷，尽量避免污染。4 .独特的缓冲体系能同时发挥逆转录酶和聚合酶的最大效果。使用方法(注意：1 ng 5 g的总RNA可以生成20 l的反应体系，总RNA量超过5 g时，请按比例扩大反应体系)。1 .将RNA铸模、底漆、2 RT-PCR Buffer、super RT/Taq Mix和RNase-Free Water溶解后放置在冰上。2 .根据下表配置反应体系，总体积为20 l。试剂25 ul反应体系最终浓度2 rt-PCR缓冲器12.5 ul1正义底漆(10 uM )1 ul0.4 uM反义底漆(10 uM )1 ul0.4 uM铸型RNA1公斤Super RT/Taq Mix0.5 ulDEPC-ddH2OUp to 20 ul3 .涡旋振动均匀，以短离心力将管壁溶液收集到管底。4 .将热循环器预热到45，将PCR管放入热循环器，进行RT-PCR反应。反应条件：注意：1 )一般PCR实验中的退火温度比放大引物的熔解温度Tm低5，退火时间一般为20 30秒，得不到理想的放大效率的情况下，适当降低退火温度； 发生非特异性反应时，通过提高退火温度，优化反应条件。2 )延长时间根据放大后的片段的大小设定，本产品所包含的DNA Polymerase的放大效率为1 kb/30s。3 )可以根据扩增产物的下游应用设定循环数。 循环次数过少，放大量不足循环次数多，失配概率增加，非特异性背景严重