生物技术概论 0绪论 1基因工程 2细胞工程.ppt

绪论,绪论,【知识目标】了解生物技术的含义、特点及生物技术的发展史。掌握生物技术的种类及其相互关系。认识生物技术对人类社会发展的影响。,第一节生物技术概述,一、生物技术的定义生物技术（biotechnology），也称生物工程（bioengineering），是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。,第一节生物技术概述,一、生物技术的定义先进的生物技术手段是指基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等新技术改造生物体是指获得优良品质的动物、植物或微生物品系。,第一节生物技术概述,一、生物技术的定义生物原料则指生物体的某一部分或生物生长过程所能利用的物质，如淀粉、糖蜜、纤维素等有机物，也包括一些无机化学品，甚至某些矿石。为人类生产出所需的产品包括粮食、医药、食品、化工原料、能源和金属等各种产品。达到某种目的则包括疾病的预防、诊断与治疗、环境污染的检测和治理等,第一节生物技术概述,二、生物技术研究的内容（一）基因工程（二）细胞工程（三）酶工程（四）发酵工程（五）蛋白质工程,第一节生物技术概述,三、生物技术涉及的学科,第一节生物技术概述,三、生物技术涉及的学科,第一节生物技术概述,三、生物技术涉及的学科,第二节生物技术的发展,一、传统生物技术的产生二、现代生物技术的发展,第二节生物技术的发展,三、生物技术对经济社会发展的影响(一)改善农业生产、解决食品短缺1.提高农作物产量及其品质2.发展畜牧业生产,第二节生物技术的发展,三、生物技术对经济社会发展的影响（二）提高生命质量，延长人类寿命1.开发制造奇特而又贵重的新型药品2.疾病的预防和诊断3.基因治疗4.人类基因组计划（HGP）,第二节生物技术的发展,三、生物技术对经济社会发展的影响（三）解决能源危机、治理环境污染1.解决能源危机2.环境保护,第二节生物技术的发展,三、生物技术对经济社会发展的影响（四）制造工业原料，生产贵重金属1.利用微生物在生长过程中积累的代谢产物，生产食品工业原料，种类繁多2.生产贵重金属,第二节生物技术的发展,三、生物技术对经济社会发展的影响（五）生物技术的安全及其对伦理、道德、法律的影响1.生物技术的安全2.生物技术对伦理、道德、法律的影响,第二章基因工程,第一节基因工程概述,一、基因工程的含义按照人们的愿望，进行严密的设计，通过体外DNA重组和转移等技术，有目的地改造生物种性，使现有物种在较短的时间内趋于完善，创造出新的生物类型，这就是基因工程的基本含义。,第一节基因工程概述,二、基因工程研究的理论依据（一）不同基因具有相同的物质基础（二）基因是可以切割的（三）基因是可以转移的（四）多肽与基因之间存在对应关系（五）遗传密码是通用的（六）基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代,第一节基因工程概述,三、基因工程操作的基本技术路线,第一节基因工程概述,四、基因工程研究最突出的优点打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，可以使原核生物与真核生物之间、动物与植物之间，甚至人与其他生物之间的遗传信息进行相互重组和转移。人的基因可以转移到大肠杆菌（E.coli）中表达，细菌的基因可以转移到动植物中表达。,第二节DNA重组,一、DNA概述（一）DNA的组成和结构,双链DNA示意图,第一节基因工程概述,终止子发夹结构模式,一、DNA概述（二）DNA的功能1.DNA分子能在细胞内复制2.携带遗传信息,第二节DNA重组,二、目的DNA片段的获得（一）限制性内切核酸酶和DNA片段化1.限制性内切核酸酶2.限制性内切核酸酶的识别序列3.限制性内切核酸酶的酶切位点4.限制性内切核酸酶反应系统5.用限制性内切核酸酶酶切DNA的方法,限制性内切核酸酶酶切DNA的位点和酶切片段的末端,DNA酶切片段电泳示意图,第二节DNA重组,二、目的DNA片段的获得（二）特异性DNA片段的PCR扩增1.PCR基本原理2.耐热性DNA聚合酶3.PCR引物4.DNA片段PCR扩增系统,PCR扩增特异性DNA片段过程,第二节DNA重组,二、目的DNA片段的获得（三）DNA片段的化学合成1.合成引物2.合成DNA寡核苷酸连杆3.合成基因片段,第二节DNA重组,三、DNA片段的连接（一）DNA连接酶（二）DNA片段之间的连接1.互补黏性末端片段之间的连接2.平末端DNA片段之间的连接3.DNA片段末端修饰后进行连接4.DNA片段加连杆或衔接头后连接,第二节DNA重组,三、DNA片段的连接（三）DNA重组类型1.插入重组2.置换重组,第三节基因克隆载体,一、质粒载体（一）大肠杆菌质粒载体,第三节基因克隆载体,一、质粒载体（二）蓝藻和大肠杆菌穿梭质粒载体,第三节基因克隆载体,一、质粒载体（三）农杆菌Ti质粒载体（四）酵母2m质粒载体,用于植物转基因的克隆载体示意图,第三节基因克隆载体,二、病毒（噬菌体）克隆载体（一）噬菌体克隆载体1.噬菌体克隆载体,第三节基因克隆载体,二、病毒（噬菌体）克隆载体（一）噬菌体克隆载体2.cosmid载体,第三节基因克隆载体,二、病毒（噬菌体）克隆载体（二）植物病毒克隆载体,35S启动子表达载体示意图,第三节基因克隆载体,二、病毒（噬菌体）克隆载体（三）动物病毒克隆载体,痘苗病毒载体示意图,第三节基因克隆载体,三、人工染色体载体大片段克隆载体,HAC构建示意图,第三节基因克隆载体,三、人工染色体载体大片段克隆载体,第三节基因克隆载体,四、体内同源重组整合载体（系统）（一）常规基因定位整合系统,第三节基因克隆载体,四、体内同源重组整合载体（系统）（二）基于噬菌体P1的CreLox定位重组系统,Cre介导几种可能发生的重组方式P:启动子；：loxp；a、b、c、d、e、f、g、h：相关基因,第四节目的基因的制备,一、目的基因的来源目的基因主要来源于各种生物。真核生物染色体基因组，特别是人和动植物染色体中蕴藏着大量的基因，是获得目的基因的主要来源原核生物的染色体基因组也是目的基因来源的候选者质粒基因组、病毒（噬菌体）基因组、线粒体基因组和叶绿体基因组也有少量的基因,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径（一）利用限制性内切核酸酶酶切法直接分离目的基因,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径（二）利用PCR直接扩增目的基因,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径（三）目的基因的化学合成,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径（四）通过构建基因组文库或cDNA文库分离目的基因1.基因组文库,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径2.cDNA文库,第四节目的基因的制备,二、分离目的基因的途径3.从基因组文库或cDNA文库中获得目的基因,第五节目的基因导入受体细胞,一、受体细胞（一）原核生物细胞（二）真核生物细胞,第五节目的基因导入受体细胞,二、重组DNA分子导入受体细胞（一）外源DNA转化方法化合物诱导转化法致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法电穿孔转化法微弹轰击转化法激光微束穿孔转化法超声波处理转化法脂质体介导转化法体内注射转化法花粉管通道转化法精子介导法低能离子束介导转化法,第五节目的基因导入受体细胞,二、重组DNA分子导入受体细胞（二）病毒（噬菌体）颗粒转导法用病毒（噬菌体）的DNA（或RT-DNA）构建的克隆载体（或携带目的基因），在体外包装成病毒（噬菌体）颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组DNA进入受体细胞。将此过程称为病毒（噬菌体）颗粒转导（transduction）法,主要用于构建基因文库和动物的转基因，早期也用于植物的转基因。,第五节目的基因导入受体细胞,三、克隆子的筛选（一）根据载体标记基因筛选转化子1.根据载体抗生素抗性基因和相应的选择药物筛选转化子,第五节目的基因导入受体细胞,三、克隆子的筛选（一）根据载体标记基因筛选转化子2根据载体除草剂抗性基因和相应的性质药物筛选转化子3.根据lacZ基因互补显色筛选转化子4.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子5.根据核苷酸合成代谢相关酶基因缺失互补筛选转化子,第五节目的基因导入受体细胞,三、克隆子的筛选（二）根据报道基因筛选重组子1.-葡萄糖酸苷酶基因（gus）2.萤火虫荧光素酶基因(luc)3.绿色荧光蛋白基因（gfp）（三）根据形成噬菌斑筛选转化子,第六节重组子的鉴定,一、根据重组DNA分子特征鉴定重组子（一）根据重组DNA分子大小鉴定重组子（二）根据重组DNA分子限制性内切核酸酶酶切图谱鉴定重组子（三）根据PCR扩增片段鉴定重组子（四）采用DNA杂交法鉴定重组子（五）应用DNA芯片鉴定重组子（六）根据DNA核苷酸序列鉴定重组子,第六节重组子的鉴定,二、根据目的基因转录产物mRNA鉴定重组子三、根据目的基因翻译产物蛋白质（酶）、多肽鉴定重组子（一）蛋白质凝胶电泳法鉴定重组子（二）免疫检测法鉴定重组子1.酶联免疫吸附法2.Western印迹法3.质谱分析法,第七节基因工程的应用和安全性问题,一、基因工程的应用二、基因工程的安全性问题,植物基因组DNA的提取,一、实验目的理解提取基因组DNA的原理，学习植物基因组DNA的提取方法。,植物基因组DNA的提取,二、实验原理利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞。在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨。离子型表面活性剂，能够使DNA得以游离出来。苯酚和氯仿能使蛋白质变性，并使抽提液分相，经离心后除去细胞碎片和大部分蛋白质。无水乙醇使DNA沉淀，大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中，用玻棒取出，小分子DNA形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。絮状DNA沉淀溶于TE溶液中，即得植物基因组DNA溶液。,植物基因组DNA的提取,三、实验仪器高速冷冻离心机，台式高速离心机，恒温水浴锅，恒温摇床，电热恒温培养箱，超净工作台，低温冰箱，制冰机，高压灭菌锅。实验试剂与用品：TrisCl，EDTA，NaCl，KAc，SDS，RNA酶A，氯仿，异丙醇，无水乙醇，TE，ddH2O,植物基因组DNA的提取,四、实验步骤1.取幼嫩的组织材料1g，用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500L提取液的离心管中，每个离心管加入0.1g，轻轻混匀。2.向管中加入50L20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65保温10min，并不时摇动。3.加入50L5molLKAc，混匀，置冰上2030min.4.4，15000rmin离心15min，转移上清液到新离心管中，加入0.7倍体积的异丙醇，混匀，-20沉淀30min。,植物基因组DNA的提取,四、实验步骤5.12000rmin离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入1mL灭菌ddH2O或TE溶解DNA。6.加入110体积的RNAaseA，37保温20min，除去RNA。7.加入110体积的3molLNaAc、2倍体积冰乙醇，混匀，-20放置20min，DNA形成絮状沉淀。8.8000rmin离心5min回收基因组DNA沉淀。9.70%乙醇漂洗沉淀DNA，再用干净吸水纸吸干。10.DNA重溶解于1mLTE，-20储存。,第二章细胞工程,第二章细胞工程,【知识目标】了解制备植物细胞及微生物细胞的原生质体并进行细胞融合的基本方法。学习进行动植物细胞及组织的培养方法。认识单倍体植物的诱发及人工种子制备的基本要领。探讨植物脱除病毒的途径和检测手段。掌握利用动物体细胞克隆哺乳动物的基本做法及其重要意义。领会干细胞芯康脑砗凸饷髑熬啊,第三章细胞工程,【技能目标】学会描述植物组织培养、原生质体融合、动物细胞组织培养及细胞融合的基本过程。掌握植物组织培养及快速繁殖的方法。,第一节细胞工程概述,一、细胞工程的基本概念细胞工程就是在细胞水平研究、开发和利用各类细胞的工程。细胞工程是一种细胞水平上的遗传工程,第一节细胞工程概述,二、细胞工程基础知识细胞是细胞工程操作的主要对象。生物界有两大类细胞：原核细胞与真核细胞。原核细胞如：细菌、放线菌等。真核细胞如：酵母、动植物等。原核细胞生长迅速，无蛋白质结合的DNA易于人们进行遗传操作，是细胞改造的良好材料。,第一节细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（一）无菌操作技术实验操作应在无菌室内进行无菌室要求注意周围环境的卫生整洁超净工作台是最基本的实验设备对生物材料进行彻底的消毒和除菌是实验成功的前提,第一节细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（二）细胞培养技术细胞培养是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长细胞培养步骤为：取材和除菌；配制细胞培养基，并对培养基进行灭菌或除菌；培养室培养,第一节细胞工程概述,三、细胞工程基本技术（三）细胞融合技术1.制备原生质体2.诱导细胞融合3.筛选杂合细胞,第二节植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（一）预备阶段1.选择合适的外植体大小要适宜。同一植物不同部位的外植体，其细胞的分化能力、分化条件及分化类型有相当大的差别。植物胚与幼龄组织器官比会化组织、器官更容易去分化，产生大量的愈伤组织。不同物种相同部位的外植体其细胞分化能力可能大不一样。,第二节植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养2.外植体的消毒灭菌外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。,第二节植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养3.配制适宜的培养基组织培养基通常都包括三大类组分：含量丰富的基本成分如蔗糖或葡萄糖高达每升30克，以及氮、磷、钾、镁等；微量的无机物，如：铁、锰、硼酸等；微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。各培养基中，吲哚乙酸和激动素的变动幅度很大，这主要因培养目的而异。,第二节植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（二）诱导去分化阶段器官切段去分化，培养基中应添加较高浓度的生长素类激素诱导外植体去分化可以采用固体培养基，在培养室中多层培养外植体表面除菌后，切成小片（段）插入或贴放培养基表面即可通常把它们置于人工照明条件下培养，以期得到绿色愈伤组织。,第二节植物细胞工程及其应用,一、植物组织培养（三）继代增殖阶段愈伤组织长出后经过46周后（四）生根成芽阶段胚状体光照是本阶段的必备外因（五）移栽成活阶段,第二节植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（一）悬浮细胞培养系统,第二节植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统1.平床培养系统,第二节植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统2.立柱培养系统,第二节植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统2.立柱培养系统要选用高产细胞株系。在营养液中加入目的产物的直接或近直接前体物质，往往对增产目的产物有特效。对各类细胞的培养都应反复摸索碳源、氮源和生长调节物质的配比，找出最佳方案。适量光照及通气在多数情况下有利于产物的生成。,第二节植物细胞工程及其应用,二、植物细胞培养和次生代谢物的生产（二）固定化细胞培养系统以下简要介绍褐藻酸钙固定植物细胞的技术路线：,第二节植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制备与融合（一）原生质体的制备1.取材与除菌2.酶解3.分离4.洗涤5.鉴定,第二节植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合1.化学法诱导融合聚乙二醇（PEG）结合高钙高PH诱导融合法2.物理法诱导融合平行电极法,第二节植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（二）原生质体的融合融合处理后再生的细胞株将可能的类型：完全的杂合植株核质异源的植株融合细胞由双方胞质及一方核或再附加少量他方染色体或DNA片段构成。原生质体融合后两个细胞核尚未融合时就过早地被新出现的细胞壁分开。以后它们各自分裂生长成嵌合植株。,第二节植物细胞工程及其应用,三、植物细胞原生质体制制备与融合（三）杂合体的鉴别与筛选1.杂合细胞的显微镜鉴别2.互补法筛选杂合细胞3.采用细胞与分子生物学的方法鉴别杂合体4.根据融合处理后再生长出的植株的形态特征进行鉴别,第二节植物细胞工程及其应用,四、单倍体植物诱发与利用（一）花药培养1.选取成熟度适中的花蕾或幼穗2.花药预处理3.选择适当的培养基与培养条件（二）花粉培养培育单倍体植株,第二节植物细胞工程及其应用,四、单倍体植物诱发与利用（三）未授粉子房或胚珠的培养充满希望的发展方向（四）杂交法获单倍体植株（五）单倍体培养物的加倍可用0.2%0.4%秋水仙素处理2448h,第二节植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（一）人工种子的构成及特点1.人工种皮2.人工胚乳3.胚状体,第二节植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制突出的优点：可以不受环境因素制约有利于保存该种系的优良性状；成本更低，更适合于机械化田间播种；可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等,第二节植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（二）人工种子的制备1.胚状体的制备及其同步生长（1）低温法：（2）抑制剂法：（3）分离法：（4）通气法：（5）渗透压法：2.人工胚乳的制备MS(或SH、White)培养基马铃薯淀粉水解物（1.5%）；SH培养基（12浓度）麦芽糖（1.5%）3.配制包埋剂及包埋褐藻酸钠,人工种子包埋示意图,第二节植物细胞工程及其应用,五、人工种子的研制（三）人工种子的贮存与萌发迄今为止尚未攻克的难关。一般将人工种子保存在低温（47）和干燥（相对湿度小于67%）条件下,第二节植物细胞工程及其应用,六、植物脱病毒技术（一）植物脱病毒途径1.物理学方法2.化学方法3.生物学方法基本流程4.综合脱毒法,第二节植物细胞工程及其应用,六、植物脱病毒技术（二）植物脱毒检测1.外形观察法2.电镜观察法3.免疫血清法,第三节动物细胞工程及其应用,一、动物细胞培养动物细胞工程从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深人探索、改造生物遗传种性，另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞、组织或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（一）细胞培养法培养动物细胞一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。将小组织块置解离液离散细胞（解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子）。低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移至培养瓶培养。,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养1.微导管培养法,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养2.微载体培养法（3）微胶囊培养法,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（二）组织培养法无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成12mm2小块，移人培养瓶。加人合适的培养基浸润组织,小心地将培养瓶平翻180，搁置1530min，以利组织块的贴壁生长。翻回培养瓶，平卧静置于37培养。,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（三）培养物的传代（四）无血清培养三大部分：基础培养基基质因子生长因子、激素和维生素,第三节动物细胞工程及其应用,二、动物细胞组织培养（五）培养物的长期保存经典传代法冷冻保存法液氮保存法为：将成熟培养物（细胞）与510的甘油或二甲亚砜混匀，封装于若干个安瓯瓶中；缓慢降温（每分钟13）至一30；继续降温（每分钟1530min）至一150；转移至液氮冻存,可无限期保存。(六)细胞组织培养污染的防治,第三节动物细胞工程及其应用,三、动物细胞融合（一）病毒诱导融合（二）化学诱导融合PEG诱导融合（三）电激诱导融合,第三节动物细胞工程及其应用,四、单克隆抗体生产技术,第三节动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（一）核移植1.异种核质关系研究2.脊椎动物克隆细胞核遗传全能性研究,第三节动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆“多莉”绵羊是如何克隆诞生的呢？,第三节动物细胞工程及其应用,五、细胞核移植与动物克隆（二）体细胞克隆意义遗传素质完全一致的克隆动物将更有利于开展对动物（人）生长、发育、衰老和健康等机理的研究。有利于大量培养品质优良的家畜。经转基因的克隆哺乳动物，将能为人类提供源源不断的廉价的药品、保健品以及较易被人体接受的移植器官。科学家将很快地从目前的同种克隆技术推进到异种克隆,第三节动物细胞工程及其应用,六、染色体转移（一）微细胞介导法图供体细胞秋水仙素处理低温处理细胞破碎高速离心收集染色体,第三节动物细胞工程及其应用,六、染色体转移直接用微注射针向胞内注射染色体悬液。将染色体与细胞共培养，染色体被细胞以胞吞的方式摄入。本法转移成功率低。将染色体与高浓度CaCl2混匀后滴加到受体细胞上，可提高成功率。用卵磷脂与胆固醇混合液制成脂质体，将染色体包裹其中，再经聚乙二醇与受体细胞融合，达到转移染色体的目的。,第三节动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究干细胞（stemcell）是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞。,第三节动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究三种类型：全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞多能性干细胞，发育潜能受到一定的限制。如：骨髓造血干细胞可分化成为至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统以外的其他细胞。专一性干细胞，这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞和肌肉中的成肌细胞等。,第三节动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究干细胞具有以下显著的特点：具有分裂成其他细胞的可能性；具有无限增殖分裂的潜能；可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；以对称或不对称两种方式进行生长。,第三节动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究三个阶段：获得干细胞系建立干细胞诱导分化模型将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,第三节动物细胞工程及其应用,七、干细胞研究优点：低毒性（或无毒性），一次治疗有效；不需要完全了解疾病发病的确切机制；用于自身干细胞移植，可避免产生免疫排斥反应。,第四节微生物细胞工程,一、原核细胞的原生质体融合G+：分别培养带遗传标志的双亲本菌株至指数生长中期分别离心收集菌体，以高渗培养基制成菌悬液混合双亲本，加入适量溶菌酶，作用2030min；高速离心后去上清液得原生质体，用少量高渗培养基制成菌悬液；加入10倍体积的聚乙二醇（40%）促使原生质体凝集、融合；数分钟后，加入适量高渗培养基稀释；涂接于高渗选择培养基上进行筛选。,第四节微生物细胞工程,一、原核细胞的原生质体融合对G+而言，在加入溶菌酶数分钟后，应添加少量0.1molL的EDTANa2共同作用1520min，则可使90%以上的革兰氏阴性细菌转变为可供细胞融合用的球状体。,第四节微生物细胞工程,