RT-PCR实验报告

反转录pcrRt-pcr是逆转录rcr(逆转录pcr)和实时pcr。反转录聚合酶链反应，或称反转录聚合酶链反应，是一种广泛使用的聚合酶链反应变体。在rt-pcr中，一条核糖核酸链被反转录成互补的脱氧核糖核酸，然后被用作通过pcr进行脱氧核糖核酸扩增的模板。将单链rna转录成互补dna(cdna)被称为“反转录”，是由依赖rna的dna聚合酶(逆转录酶)完成的。随后，另一条dna链通过脱氧核苷酸引物和rna依赖的dna聚合酶完成，每个周期加倍，即正常的pcr。最初的rna模板被rna酶H降解，留下互补的dna。rt-pcr的指数扩增是一种非常敏感的技术，可以检测具有非常低拷贝数的rna。Rt-pcr广泛用于遗传病的诊断，并可用于定量监测某些rna的含量。(关于检测基因表达的方法，参见northern印迹法。)Rt-pcr有时指实时pcr。为了区别于逆转录聚合酶链反应，它通常被写成“定量聚合酶链反应”或RTQ-聚合酶链反应(实时定量聚合酶链反应)。实时聚合酶链反应Pcr(实时pcr)是定量pcr(q-pcr)的一种，它根据一定时间内dna的增加进行定量分析。目前在实时pcr中有两种定量使用荧光色素的方法。一种是在ds dna中插入特定的荧光色素。另一种是使用荧光探针，它可以与扩增的dna序列中的特定寡核苷酸序列结合。实时聚合酶链反应与反转录聚合酶链反应相结合，可以在特定的时间、细胞和组织中发现特定表达的基因，并带有微量的rna。这两种逆转录聚合酶链反应的结合也被称为“定量逆转录聚合酶链反应”Rt-pcr技术相关试剂Oligo:多聚体，相当于mrna引物Amv:逆转录酶Dntp:脱氧核苷酸核糖核酸酶：核糖核酸酶抑制剂Pcrbuffer: rt-pcr缓冲液氯化镁：二价镁离子聚合酶链反应步骤的目的预变性：破坏dna中可能难以破坏的二级结构。为了使dna完全变性并减少复杂的dna结构对扩增的影响，以便更好地组合引物和模板，特别是来自基因组的dna模板，最好不要吝啬。增加这一步。此外，在一些用热启动taq酶的反应中，taq酶也可以被激活，从而使pcr反应顺利进行。(2)变性-退火-延伸循环：(1)模板dna的变性：在将模板dna加热到约93一段时间后，通过pcr扩增形成的双链模板dna或双链dna被解离形成单链，从而可以与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板dna和引物的退火(复性):加热使模板dna变性为单链后，温度降至55左右，引物与单链模板dna的互补序列配对结合；(3)引物延伸：dna模板-引物组合在聚合酶作用下，以脱氧核糖核酸为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，合成了一条与模板dna链互补的新的半保守复制链。(pcr仪扩增循环后72度延伸10分钟当通过pcr仪器进行扩增时，循环(变性、退火、延伸)完成后，72度延伸持续10分钟的原因是：1.延伸时间取决于待扩增dna片段的长度。(当然，在反应系统的某些条件下)例如，当使用taqdna聚合酶时，72度时的碱基结合率为35-100bp/s，因此延伸率为1kb/min。2.根据延伸速率，1kb内的dna片段可以扩增1分钟，而3-4kb需要3-4分钟，依次推进。通常，在最后一轮，有必要适当地转移延伸时间延长至4-10分钟，从而完成pcr反应以提高扩增产率。3.72度延伸10分钟，不仅可以使pcr反应完成，提高扩增产率，而且在用普通taq酶进行pcr扩增时，还具有在产物末端添加尾部的效果，可直接用于ta克隆。什么是半定量pcr半定量逆转录聚合酶链反应(SQRT-pcr)是近年来常用的一种简单而特异的定量rna测定方法。通过将mrna逆转录成cdna，进行pcr扩增并测定PCR产物的数量，可以估计样品中特异性mrna的相对数量。基于半定量rt-pcr的mrna含量测定技术比含有内标rt-pcr的方法更简单、更可行。该方法不另设“内标”，消除了两对不同引物之间的相互抑制和灵敏读数差异，具有明显的量效关系和良好的重复性。步骤：1。rna提取；2.逆转录获得cdna3.以cdna为模板的聚合酶链反应注：步骤1，Rna提取质量必须更好，注意污染。常用的内部参考是肌动蛋白和gapdh。第三步，半定量rt-pcr应在另外两个试管中进行，一个用于内部参考基因，另一个用于目标基因，以便于控制，并可在绘图时在一个泳道中运行。指数期和台湾期必须清楚理解！半定量rt-pcr和荧光定量实时pcr的最大区别在于，半定量pcr需要运行电泳，根据条带亮度的强弱来判断模板的拷贝数或表达水平，而实时pcr可以在不电泳的情况下实时监控整个pcr过程，并根据给定的ct值和标准曲线来判断基因的拷贝数。因此，从上面可以看出半pcr不如实时pcr准确。Rt应该指逆转录。为了更容易区分，我们更喜欢使用qpcr来特指实时pcr。同时，要注意实时pcr的定性问题。有时你扩增的可能只是引物二聚体。因此，如果是第一次对目标基因进行实时聚合酶链反应，或者在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，以确保与您想要扩增的目标基因大小相同，则使用熔解曲线。Rt-pcr只能通过模板pcr后的扩增结果间接反映初始模板的数量。然而，实时pcr结果直接显示初始模板的数量。所以，real time-PCR更准确。标题二：rt-pcr实验方法逆转录聚合酶链反应实验4反转录聚合酶链反应(rt-PCR)目标 1。了解逆转录聚合酶链反应获得目的基因的原理。2.学习和掌握逆转录聚合酶链反应的技术和方法。实验原理聚合酶链式反应(pcr)过程使用模板变性、引物退火和引物延伸的多个循环来扩增dna序列。因为前一轮的扩增产物用作下一轮扩增的模板，所以它是一个指数增加的实验四反转录pcr (rt-pcr)实验目的1.理解通过逆转录聚合酶链反应获得目标基因的原理。2.学习和掌握逆转录聚合酶链反应的技术和方法。实验原理Rt-pcr技术灵敏，应用广泛，可用于检测基因表达水平、表达差异、细胞内rna病毒含量以及直接克隆特定基因的cdna序列。Rt-pcr比包括northern印迹、核糖核酸酶保护分析、原位杂交和s1核酸酶分析在内的其他rna分析技术更灵敏、更容易操作。rt-pcr的基本原理(图4.1)。首先，cdna是在逆转录酶的作用下由rna合成的，即总rna中的m rna在体外被逆转录合成dna拷贝，这被称为互补dna (cdna)，因为拷贝的DNA的核苷酸序列与模板mrna完全互补。然后，使用dna聚合酶，以cdna的第一条链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸(dntp)为材料，在引物的指导下复制大量的cdna或靶片段。在rt中，有3种引物可供选择(表4.1)。利用1)和2)方法，理论上，所有扩增的cdna将被用作进一步扩增的pcr模板。如果使用3)的方法，首先转到/重新键入/缩放/7b 17 bdaf 89 EB 172 ed 63 b 7a 3？pn=2x=0y=1268 raww=535 rawh=340 o=png _ 6 _ 0 _ 0 _ 135 _ 265 _ 601 _ 383 _ 892.979 _ 1262.879 type=picaimh=305.04672897196264 MD 5 sum=388 ad 1889 e 15 cfe 390 dec 00721 a2 ce 0 sign=8cc C656492 zoom从图4.1不难看出，随机引物法在三种方法中具有最低的特异性。引物在转录物的多个位点退火，产生短的、部分长度的cdna。这种方法通常用于从具有二级结构区或逆转录酶不能复制的终止位点的rna模板中获得5-末端序列和cdna。为了获得最长的cdna，需要根据经验确定每个rna样品中引物与rna的比例。随机引物的初始浓度为每20l反应体系50-250 ng。因为使用随机引物从总rna合成的cdna主要是核糖体rna，模板通常是聚(a) rna。寡核苷酸比随机引物具有更高的特异性。它与在大多数真核细胞的mrna 3末端发现的聚(a)尾杂交。因为聚(a) rna约占总rna的1%至2%，所以cdna的数量和复杂性远低于使用随机引物。由于其高特异性，寡核苷酸(dt)通常不需要优化rna与引物的比例和多聚核苷酸(a)的选择。建议每20l反应系统使用0.5g寡核苷酸(dt)。寡核苷酸(dt)12-18适用于大多数rt-pcr。基因特异性引物(gsp)是反转录步骤的最佳引物。Gsp是一种反义寡核苷酸，可以与rna靶序列特异性杂交，而不是与所有rna退火，如随机引物或寡核苷酸(dt)。设计pcr引物的规则也适用于反转录反应gsp的设计。gsp可以与退火到mrna 3末端的扩增引物序列相同，或者gsp可以设计成退火到反向扩增引物的下游。像普通dna一样，制备的双链cdna可以插入质粒或噬菌体。出于这个原因，它首先是必要的存在合适的接头，其可以是添加到pcr引物中的限制性酶识别位点片段，并在pcr扩增后克隆到相应的载体中。或者，末端转移酶可用于将寡dg和dc或dt和da尾的片段连接到载体和双链cdna的末端，退火形成重组质粒，并转化到宿主细菌中进行扩增。本实验从小鼠肝组织中获得fas配体基因。fas配体(fasl)是一种型跨膜糖蛋白，分子量约为40u，属于tnf家族。活化的T细胞可表达fas和fasl，并通过fas/fasl系统介导细胞凋亡，维持免疫系统的稳态。最近的研究发现，fasl在一些癌细胞中的表达增强，并且与肿瘤复发和转移相关。我们用rt-pcr方法克隆了fasl全长cdna，并构建了表达载体，为fasl功能的进一步研究提供了条件。限制性内切酶切割位点及其保护性碱基(hind iii和bamh i)分别添加到上游和下游引物的5端，以便通过双酶切割将目标片段定向克隆到原核表达载体pgfpuv中(附录图4.3)。为了便于后续的实验，目的蛋白可以通过金属螯合和色谱分离纯化，我们对pgfpuv进行了修饰，并在其上添加了6个his标签。试剂和设备(1)试剂1.总rna(或mrna)2.核糖核酸酶抑制因子):40 u/ml3.dntp混合物(每个10毫米)4.oligo(dt)12-18:2.5？mol/l5.10*逆转录合成缓冲液(10？rt缓冲液):250 mmol/l tris-hcl (ph8.3)，375 mmol/l kcl，15 mmol/l mgcl26.amv逆转录酶5u/？l7.基因特异性5和3引物各20？mol/l8.点击dna聚合酶5u/？l9.10*pcr缓冲液：500毫摩尔/升kcl，100毫摩尔/升tris？Cl，ph9.0，1.0% triton x-100，15mol/l MgCl 2，25。(2)设备1)pcr仪器，2)pcr管，3)微量移液器操作方法反转录：1)建立反应体系：2)涡旋混合，在42反应1小时，在95加热5分钟，然后置于冰上。(2) pcr扩增：1)建立pcr反应体系：2)涡旋并均匀混合上述反应系统，并按照以下程序运行循环：步骤2-4运行30个循环，复性温度主要根据不同的引物而不同。(3)取10-20微升的聚合酶链反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余的聚合酶链反应产物保存在-20.注意事项和提示1.在逆转录反应过程中，应建立一个无核糖核酸酶的环境，以避免核糖核酸降解。2.成功的逆转录依赖于高质量的模板rna。高质量的rna应该至少是全长的，不含逆转录酶抑制剂，如乙二胺四乙酸或十二烷基硫酸钠。此外，rt-pcr遇到的一个潜在困难是基因组dna被rna污染。使用更好的rna分离方法，如trizol试剂，将减少rna制剂中的污染。第三部分：rt-pcr实验方法概述rt-pcr实验方法综述rt-pcr实验有三个步骤：rna提取、rt和pcr。要求：1.rna浓度必须在rt前测定，逆转录系统对rna量仍有一些要求，通常为500ng或1ug。2.rt应该按照要求做，一般不会有太多问题。3.pcr和往常一样。然而，如果片段需要扩增，前两步需要很高，并且需要完整的cdna，这不能通过改变mg2浓度和退火温度来解决。1)在设计用于1)rt和pcr的引物之前，我们必须知