农杆菌介导的水稻遗传转化原理及技术

农杆菌介导的水稻转基因原理和技术、水稻转基因是水稻分子生物学研究和遗传改良的关键技术基础，比较了一些常用植物转基因方法、农杆菌介导方法的优点、 操作简便的外源基因插入一般可以单拷贝或低拷贝转移DNA片段，大片段DNA可以直接在不同植物组织中转移基因，农杆菌传播基因转化原理是农杆菌为革兰阴性土壤杆菌， 根农杆菌(导致毛状根的发生)和根癌农杆菌(引起冠心病，冠心病细胞产生正常细胞不能产生的冠瘿碱)。 根癌农杆菌转移到植物中，含有引起植物肿瘤的质粒(Ti质粒)。 根癌农杆菌的Ti质粒由毒性区(Vir区)、结合区(Con区)、复制起始区(Ori区)和tdna区4个部分组成，其中与冠心病的生成有关的是Vir区和tdna区。 T-DNA区的左右边界分别具有25bp的重复序列，其中14bp为核心，分为10bp(CAGGAATATAT )和4bp(GTAA )不连续的两组，完全保守。 Vir区为30Kb，由VirA、VirB、VirC、VirD、VirG、VirH等7个操纵子共计24个基因控制。 Ti质粒结构图、农杆菌感染过程、受损植物细胞作为农杆菌感染信号产生植物酚类化学衍生物透过农杆菌细胞膜，激活VirA和virG基因，激活vir区其他基因的vir基因， 作用于T-DNA加工和T-DNA转移的T-DNA进入植物细胞与核DNA合并的T-DNA在表达植物细胞中产生冠痹碱和植物激素的农杆菌Ti质粒上有特异的类胡萝卜素降解酶基因(ocs )， 该基因开始合成各种酶，分解植物细胞产生的类胡萝卜素作为唯一碳源和氮源的冠瘿碱，农杆菌的附着和活化tra基因有利于Ti质粒的结合转移，扩大了感染范围，根癌农杆菌通过基因转化转化T-DNA上的基因BiologyofA.tumefaciens， a.tumefaciensilivesaroundrootsurfces (inrhizosphere ) wheriretusingnutrientsthantleakfromtheroottissues inforteconsonlythrughwondersandactivitychemotactthem，plantwondproducedstacetor bacteralt-plassimidproducteceptorforacetosyringone，producceclustrustransformallustrustimestemetrusteshootingbyscytokininaddie thissprocedurdeseiseastordicotyldoneplants (legumes dist )， 农杆菌介导水稻的水稻根癌农杆菌转化技术流程、愈伤组织诱导、共培养、抗性愈伤组织的筛选和再生需要完整的植物体系1 .一种高密度根农杆菌液感染和共培养干燥处理，其特征在于，用于、的胚性愈伤组织化的传代次数为8代以下； 共培养后有效去除农杆菌或抑制农杆菌生长(适宜的抗生素及其浓度)。 快速筛选(23次筛选)快速分化再生。 一、培养基、基本培养基为NB培养基，愈伤组织诱导、转化及分化等培养基配方如下：1.诱导培养基： nb 2，4-d2mgl-1； pH5.8-5.9。 2 .预培养基： nb 2，4-d2mgl-1； pH5.8-5.9。 3 .共培养培养基： nb2，4-d2mgl-1as 100 ml-1； pH5.2。 4 .培养基：选择nb 2，4-d2mgl-1羧苄基青霉素250mgL-1 Hyg30-50mgL-1，pH5.8-5.9。 5 .分化培养基： NB KT10mgL-1 NAA0.4mgL-1； pH5.8-5.9。 6 .生根培养基：1/2MS； pH5.8-5.9。 二、胚性愈伤组织的诱导和传代，水稻授粉后取15-20d的未成熟穗，剥去未成熟种子，用75%乙醇浸泡1min，再放入25%次氯酸钠溶液中振荡灭菌，在超清洁台用无菌水洗涤3-5次，将消毒种子幼胚筛选接种至诱导培养基，盘子从第三代开始，可以选择适合农杆菌转化的胚性愈伤组织。通过、胚性愈伤组织、三、农杆菌转化水稻，1 .愈伤组织的预培养选择自然分散、色泽鲜艳的黄色、直径约2-3mm的颗粒状愈伤组织，转移至预培养基，在27暗培养4天。2 .农杆菌的培养和处理从低温(-85)冷冻保存管中提取少量菌液，在Kan50mgL-1和Rif50mgL-1YEB固体培养基中划线后，在28下暗培养3672h，取出活化的活化平板上的单菌落，在28下培养2天后， 在添加了适量的100ML-1乙酰丁香(AS )的AAM培养基中使细菌溶出，悬浮在添加了100ML-1乙酰丁香的20mlAAM培养基中，剧烈振荡1分钟后，将菌液浓度调整为OD600nm=1.52.0，静置1h，农杆菌形成悬浊液3 .在共培养预培养的愈伤组织化灭菌培养瓶中，加入上述处理过的农杆菌液，稍微摇晃后静置30min，用无菌滤纸愈伤组织化后，接种到共培养基中，在25下暗培养3d。 4 .将农杆菌洗涤，取出共培养后的愈伤组织，用无菌水洗涤35次，每次摇动，洗涤至水中无丝状菌体。 最后用含有250mgL-1羧苄基青霉素的无菌水静置1h，晾在无菌滤纸上。 愈伤组织的筛选将愈伤组织转移到选择培养基，筛选抗性愈伤组织，每两周转移一次。抗性愈伤组织、非抗性愈伤组织、6 .抗性愈伤组织的传代和植物的再生每2周向新的选择培养基转移愈伤组织，约3周可见肿瘤状生黄抗性愈伤组织从褐化干燥的愈伤组织中生长。 愈伤组织生长后选择性地将抗性愈伤组织的一部分转移到分化培养基中。 2周后愈伤组织化变成绿色，3周后长出嫩芽，之后也长出了根。 将幼苗移植到生根培养基中，每个培养瓶制作一个克隆