基因工程-7章 PCR技术及其应用.ppt

PCR反应的模板,重组质粒DNA基因组DNARNA菌落,图1口腔腺中提取的RNAM:DL2000marker;1:5LRNA;2:10LRNA;3:15LRNA.,M123,28S,18S,5S,2020/6/11,4,第七章PCR技术及其应用,一、PCR技术原理二、PCR技术的主要类型三、PCR技术应用,2020/6/11,5,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,解链酶,一、PCR技术原理,2020/6/11,6,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,2020/6/11,7,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,DNA聚合酶,DNA聚合酶,2020/6/11,8,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明,2020/6/11,9,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,2020/6/11,10,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,2020/6/11,11,DNApolermasesforPCR:,Thermusaquaticus,古细菌-水生栖热菌,2020/6/11,12,TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus),酶活性(%),温度(),405060708090100,10080604020,2020/6/11,13,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,特定DNA片段,2020/6/11,14,72,94,55,PCR循环,2020/6/11,15,PCR技术简史,DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明,2020/6/11,16,PCR的基本原理,类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,2020/6/11,17,2020/6/11,18,PCRCycle-Step1-DenaturationTemplateDNAbyHeat(95),TargetSequence,TargetSequence,PCR原理示意图,模板DNA的变性：模板DNA经加热至93-95左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；,2020/6/11,19,PCRCycle-Step2Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,2020/6/11,20,PCRCycle-Step3-At72TaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated,TargetSequence,TargetSequence,Primer1,Primer2,5,3,5,5,3,5,3,3,TaqDNAPolymerase,引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。,2020/6/11,21,Endofthe1stPCRCycleResultsintwocopiesoftargetsequence,TargetSequence,TargetSequence,每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,2020/6/11,22,被扩增的DNA片段,模板DNA变性引物与模板退火,引物延伸,模板DNA变性引物与模板退火引物延伸,引物延伸,循环1,循环2,循环3,模板DNA变性引物与模板退火,212,224,238,25次循环后，被扩增的DNA片段的拷贝数为225附图,TargetAmplification,2020/6/11,23,TargetAmplification,No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,824,1cycle=2Amplicon,2cycle=4Amplicon,3cycle=8Amplicon,4cycle=16Amplicon,5cycle=32Amplicon,6cycle=64Amplicon,7cycle=128Amplicon,2020/6/11,24,PCR反应体系,缓冲溶液(Mg2+是DNA聚合酶的激活剂)耐热DNA聚合酶脱氧核糖三磷酸核苷酸(dNTPs)模板DNA或cDNA上游引物、下游引物,2020/6/11,25,（1）PCR反应缓冲液,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2020/6/11,26,（2）TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)0.5-5U/100L酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,2020/6/11,27,（3）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等,一般为50-200mol/L浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,2020/6/11,28,（4）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,2020/6/11,29,（5）引物浓度0.1-1mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。,2020/6/11,30,PCR引物的设计一般原则,引物长度一般以1530bp为宜,过短则降低特异性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和A/T碱基均匀分布，G/C含量在4555%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。,2020/6/11,31,要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。引物3末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C或T时引物效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,2020/6/11,32,例1.引物的3末端形成杂交5GGCTATACCGATTCGAATCA33ACTAAGCTTAGCCATATCGG5例2.引物的5末端形成杂交5ATCGATCGATGGCATGGTAT33TATGGTACGGTAGCTAGCTA5例3.引物的中间部分形成杂交5AACGAGCTTCGAAGGCTAA33AACGAGCTTCGATGGCTAA5例4.5CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC3引物设计软件：Primer5,Oligo6,目的基因上游引物设计,目的基因下游引物设计,2020/6/11,41,PCR一般循环参数变性使双链DNA解链为单链,9535分钟(2)退火温度由引物长度和GC含量决定,适宜的退火温度大约低于引物Tm值45-55，介于45-55。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。,Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。Tm（）（）,2020/6/11,42,（3）延伸72，延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加,2020/6/11,43,标准的PCR反应条件：,10缓冲液10L4种dNTP混合物各200umol/L引物各10100pmol模板DNA0.12gTaqDNA聚合酶2.5UMg2+1.5mmol/L,2020/6/11,44,PCR仪,2020/6/11,45,模板DNA,2020/6/11,46,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,2020/6/11,47,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,2020/6/11,48,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,2020/6/11,49,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,2020/6/11,50,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,第2轮结束,2020/6/11,51,PCR的基本原理,PCR反应条件PCR过程PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,理想拷贝数=2nn循环次数实际拷贝数=(1+x)nX平均效率,约为0.85n循环次数,附图,2020/6/11,52,PCR反应注意的事项,（一）防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照：阳性对照：阳性模板阴性对照：阴性模板试剂对照：除模板外的所有组分,2020/6/11,53,PCR反应的特点,灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24h完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。,2020/6/11,55,1、反转录PCR(RT-PCR)2、反向PCR3、复合PCR4、不对称PCR5、嵌套PCR6、3FullRACE7、5FullRACE8、实时定量PCR,二、PCR技术的主要类型,2020/6/11,56,1、反转录PCR(RT-PCR)是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现mRNA多态性,克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。,2020/6/11,57,反转录酶具有依赖于RNA的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性，AMV(42)和MMLV（37）。,2020/6/11,58,双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,2020/6/11,59,5,3,AAAAA,5,3,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,RT-PCR原理,mRNA,1stcDNA,反转录酶、下游引物、dNTPs,TaqDNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs,5,5,3,3,特异PCR产物,5,5,3,3,经30个循环，产生230个分子拷贝,5,5,3,3,2020/6/11,60,MLVRT催化的cDNA合成,RT-PCR引物选择,2020/6/11,63,2、反向PCR(reversePCR),是用反向引物对某个已知DNA片段两侧未知序列进行的PCR。可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA。,已知序列,未知序列,未知序列,2020/6/11,64,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,2020/6/11,65,3、复合PCR(或称多重PCR)在一个反应体系加入多对不同的PCR引物同时扩增，获得多个PCR产物，这种PCR称为复合PCR。用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,2020/6/11,66,4、不对称PCR是指用不等量的一对引物产生大量单链DNA的PCR。方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。用途：制备核酸序列测定的模板制备杂交探针基因组DNA结构功能的研究,2020/6/11,67,高浓度引物,低浓度引物,2020/6/11,68,5、嵌套PCR(或称巢式PCR),是指先后用两套引物进行扩增的PCR。用第一套引物扩增1530个循环；再用扩增DNA片段内设定的第二套引物扩增1530个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增。,6、3FullRACE,7、5FullRACE,5-flankingregionofchickenovalbumingene,2020/6/11,76,8、实时荧光定量PCR(real-timePCR):美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术。通过特定设计的PCR仪器检测PCR扩增过程每一轮循环产物标记的荧光信号累积数量，从而进行实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析,称为实时荧光定量PCR。以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。,（1）SYBRGreenI检测模式,通过PCR反应生成双链DNA，SYBRGreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。SYBRGreenI的优点：SYBRGreenI的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。,2020/6/11,79,（2）水解探针模式（Taqman探针）,发射基团,荧光淬灭基团,5,3,该探针可与扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交,探针的5端标以荧光发射基团,靠近3端标以荧光淬灭基团,探针3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。,2020/6/11,80,2020/6/11,81,2020/6/11,82,工作原理是利用Taq酶的53外切酶活性。在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，它与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。探针的5端标记荧光发射基团(荧光发射峰值在518nm处)，3端标记荧光淬灭基团(荧光发射峰值在582nm处)且被磷酸化，以防止探针3端在PCR扩增过程中被延伸。,2020/6/11,83,当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当Taq酶移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。,实时定量PCR法检测Lj-HMGB2基因在各组织中含量,2020/6/11,85,三、PCR技术应用,1.基础研究基因或cDNA克隆：从基因数据库中获得某一基因或cDNA核苷酸序列,用PCR方法扩增并克隆该基因或cDNA。基因表达：用RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。2.医学感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝病毒等。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。恶性肿瘤的诊断。,2020/6/11,86,3.法医学中的基因和亲子鉴定,DNA指纹图谱1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人体核DNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为DNA指纹，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。,简单序列重复(SSR)实验方法,现场嫌疑人1嫌疑人2嫌疑人3,法医鉴定,案例一,母亲儿子男性1男性2男性3,亲子鉴定,案例二,4.考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定5.基因动、植物的检测转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因植物的检测：玉米、大豆等。,物种进化图,2020/6/11,94,1、要求将下面基因片段克隆至表达载体pET-28a相应位点上，并获得此基因的表达。ATGGGTCGGCATGCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGACCATGGTTGGTATTTAGCTTATTCTATACCTGACACAGGGGAATCACAAATAAGAAAATTTTCAGCATTAGCTAGATATGAATGGCAAAGAGGAAACTATAAACAAGCTACATTCTATCTTGGAGAGGCTATGCACTATTTTGGAGATATAGATACTCCATATCATCAAGCTTATGTTACTGCCGTTGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGAGACTTTTGCAGAGGAAAGAAAAGAACAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGCTTTTTATACTGATATCTTAAAAAACAAAGATTTTAATGCATGGTCAAAAGAATATGCAAGAGGTTTTGCTAAAACAGGAAAATCAA