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阴道益生菌制剂及其应用,大连医科大学微生态学研究所大连亿佰亿生态产业发展有限公司康白袁杰力左振军,医学思想领域的革命,第一次革命：机械医学（治疗医学）第二次革命：生物医学（预防医学）第三次革命：生态医学（保健医学）,人类生存所面临的环境问题,大环境宏观生态小环境微观生态,微生态学发展的历史回顾,1681leeuwenhoek直接镜检1881Koch纯培养技术1857Paster细菌发酵作用1886Escheric发现大肠杆菌群,婴儿主导菌群1845-1916梅挈尼克夫斯基肠道菌群有害作用1890Dderlein发现德氏乳杆菌，奠定阴道微生态学的基础1899Tisser发现双歧杆菌1900Moro发现乳酸杆菌,研究肠菌群分布，提出相关理论1935Eggerth发现类杆菌1945Fleming发现抗生素1945Reynier无菌动物饲养成功（悉生动物学的提出）1957Haenel改进厌氧培养技术1960Dubus原籍菌群与外籍菌群观点的引入2002东京会议正常微生物群是人（动物）生存必须的一个系统,微生态学科的建立,1977年，由西德的VolkerRush首先提出：微观生态学，简称微生态学（microecology）概念1977年，康白、魏曦提出：生态防治（菌群调整理论）1979Vanderwaaij.提出：定植抗力理论1981kangbai提出：生物夺氧理论1985VolkerRush提出：微生态学是细胞水平或分子水平的生态学1988Xiangjinmin提出：分子生态学概念,微生态学研究的意义,微生态学是研究人体正常微生物群的结构功能、及其与宿主相互关系的学说正常微生物群是生命的重要组成部分正常微生物群能增强宿主的免疫功能，增加营养，帮助消化，拮抗致病菌的定植和入侵正常菌群分布于全身各部位，其中阴道微生态是人体第二大的微生态系统,人体微生态系统,人体正常菌群种类达500余种数量达100万亿个（人体体细胞只有10万亿个）重量约1271克，相当于肝脏的重量99.9%是以双歧杆菌和类杆菌为主的专性厌氧菌0.1%是以肠杆菌科细菌为主的兼性厌氧菌,1g,1000g(78.67%),20g,200g,20g,10g,20g,正常菌群的定义,在正常人、动物和植物的体表或体内通常有一层微生物存在，但并未引起不正常或致病现象。这一微生物层通常称为正常菌群。是与其宿主在共同的历史进化过程中形成的微生态系统中的正常微生物成员，即寄居在特定个体体内的非但无害而且有益的微生物群落。人体的正常菌群以肠道最多，肠道菌群也最具有代表性。,健康人肠道菌生理性演替,肠道菌群的生理功能,肠道菌群在肠肝循环中起重要作用肠道菌对营养代谢的影响肠道菌群的生物拮抗作用肠道菌群的免疫防卫机制肠道菌群与有毒物质的产生及清除,阴道正常微生物群的构成,主要常住菌有：主要包括乳杆菌、双歧杆菌、优杆菌、消化链球菌、葡萄球菌、链球菌、棒状杆菌、肠杆菌、丙酸杆菌、梭状芽胞杆菌、支原体、类杆菌、韦荣氏小球菌、肠杆菌及需氧芽胞杆菌、酵母菌及包括滴虫在内的等原生动物等成员。优势菌中需氧菌和兼性厌氧菌的排列顺序是:lactobacillus，Staphylococcus,Corynebacterium,Streptococcus,Garderellavaginalis.优势菌中专性厌氧菌的排列顺序是:Lactobacillus,Bacteroides,Peptostreptococcus,Fusobacterium,Veillonella.,阴道微生态生理学背景,阴道道微生物菌群是一具庞大复杂性的生态系统10万亿个微生物100种类型大部分是未知的效果健康提升潜在的副作用微妙平衡可能被多样因素所扰乱阴道微生物菌群对健康是重要的,健康妇女阴道生理及微生态演替,阴道微生态平衡是菌群特点,从总体上来说，专性厌氧菌的含菌量总数比需氧菌和兼性厌氧菌两者菌数总和要高出10倍。专性厌氧菌中乳杆菌含量占优势。滴虫在正常妇女阴道亦有检出。临床特点为无症状带虫现象。革兰氏阴性杆菌：如阴道嗜血杆菌，类杆菌和梭杆菌在健康妇女的分离率为1440%。这些菌与细菌性阴道病的发生有关。细菌性阴道病时这些菌比正常水平高100-1000倍。,阴道微生态平衡的影响因素,环境,宿主,微生物,理化影响,内分泌变化：月经、妊娠、绝经阴道损伤:分娩、手术、外力免疫功能低下:激素、免疫抑制剂、抗肿瘤药全身性疾病阴道不当冲洗,抗生素滥用,LacticacidH2O2VFAenzymes,NH3、H2SIndolePhenolAmines,nutrients,Y,Y,Y,Y,Y,Mucosalimmunesystem,阴道正常菌菌群的作用,阴道微生态失调,致病菌,条件致病菌,阴道乳杆菌在数量上处于绝对优势地位，是维持阴道微生态平衡的前提和基础,乳杆菌,乳杆菌,微生态平衡,微生态失调,内源性感染,外源性感染,阴道菌群失调的生态防治,微生态防治是指顺应机体微生态系统的生态网络结构及规律，因势利导，通过综合生态防治措施，改善宿主的微生态环境，重新建立微生态平衡。微生态防治的主要措施，原则上包括改善微生态环境；增强宿主的适应性；合理、有效、短期的抗生素使用；提高宿主的定植抗力；使用益生菌制剂微生态调节剂等。其中益生菌制剂是微生态防治过程中使用的最有效手段和武器。,合理应用抗生素,抗生素的发现使人类与感染的斗争发生了质的飞跃，拯救了千万甚至上亿人的生命。但抗生素的广泛应用也给人们带来了沉痛的代价。抗生素在杀灭致病菌的同时，也杀灭了有益菌，造成菌群失调，更为严重的是抗生素的应用使细菌产生耐药性及传播性，使得内源性感染增加并难以控制。,1、尽量选用不干扰或少干扰机体定植抗力的抗生素2、应选择有针对性的窄谱抗生素，短疗程适当剂量使用3、尽量选用胃肠道外给药途径4、在使用抗生素的同时使用益生菌制剂（边抗边调）5、使用抗生素后应用益生菌调整（先扛后调）,合理应用抗生素原则,应用益生菌制剂,益生菌制剂能直接补充机体的正常菌群或选择性刺激正常菌群的生长繁殖，从而竞争性抑制潜在致病菌的过度生长及定植，提高肠道的定植抗力，防治细菌和/或内毒素移位。又称益生菌制剂的生态疗法。,益生菌的定义,益生菌(Probiotics)又称生态制品、活菌制剂。1977年Spert把益生菌描述为能促进肠道菌群平衡的微生物或促进物质。1989年，Fuller把益生菌定义为能够促进肠内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活的微生物制剂。2002年，益生菌是活的微生物，通过摄入充足的数量，对宿主产生一种或多种特殊且经论证的功能性健康益处。（欧洲食品与饲料菌种协会2002）,阴道益生菌制剂的作用机制,1、生物拮抗：阴道正常微生物群在种类和数量上正常的情况下，对外来的细菌或致病菌具有明显的拮抗作用，保护阴道菌群不受侵害，不受感染。2、刺激阴道粘膜细胞的活性：保持阴道粘膜健康状态和正常的分泌功能，提高性行为的效果。3、促进女性生殖系统的生长发育：女性生殖系统包括大小阴唇、阴蒂、阴道、后穷窿、子宫颈、子宫内膜、输卵管及卵巢，所有这些部位的生长发育或其他功能都与阴道正常微生物群有密切的联系，因为在菌群失调的情况下，整个生殖系统都会有器质性和功能性的变化。4、自净作用：阴道菌群有分解腐败物质及老废物的作用。异常分泌物如白带、月经残余物、恶露及鱼腥味等异常气味都会被正常阴道菌群自净作用而清除。5、免疫调节：人体正常微生物群主要是肠道、呼吸道、口腔、皮肤及阴道的菌群均具有免疫调节作用，使人体细胞免疫与体液免疫保持平衡状态，使人体“自稳机制”（homoestasis）正常运转起来。,阴道益生菌生产菌株的筛选,益生菌菌株的分离和选种益生菌菌株的活性和活存能力对菌株生产性能的考察益生菌对体内环境耐受能力黏附和定植能力的研究抗微生物能力的研究健康效果,国内治疗用益生菌制剂的状况,阴道益生菌药用制剂德氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌。阴道生态消毒剂双歧因子、含菌制剂、代谢产物、中药制剂,阴道炎外用制剂的分类,抗生素制剂,微生态制剂,中药制剂,原籍菌制剂,共生菌制剂,生物放大作用强,活菌定植时间长,生物拮抗作用强,治疗安全性更高,体内繁殖受限制,存在条件致病性,亿佰亿健康护理液,粪肠球菌制剂,活菌停留时间短,主要与乳杆菌共生起效,理想阴道微生态制剂的判断标准,阴道原籍菌制剂（乳杆菌制剂）所选菌株为无毒菌株单位活菌含量高制剂稳定性好剂型合理价格低廉,阴道乳杆菌活菌制剂,早在1915年，就有人提倡用乳杆菌培养物进行膀胱灌洗治疗重度膀胱炎，并获得较好的疗效。在抗生素时代之前，不论是在民间或是在医疗界，使用乳杆菌培养物冲洗阴道法治疗急性淋菌性外阴阴道炎成功的例子是很多的。70年代，80年代英国，美国等发达国家也相继有了关于使用乳杆菌治疗阴道炎的报道。1978年德国报道用乳杆菌治疗滴虫性阴道炎，应用乳杆菌治疗一年后96%再检查，92.5%临床完全治愈。近年来，我国关于乳杆菌制剂治疗各种阴道炎的报道也较多。1999年北京协和医院用乳杆菌活菌胶囊治疗细菌性阴道炎与灭滴灵相比较。结果提示：乳杆菌活菌胶囊是治疗细菌性阴道病的安全有效药物，治疗效果肯定，与灭滴灵相比无显著性差异。,乳杆菌制剂在细菌性阴道病治疗中的应用,细菌性阴道病（BV)是阴道微生态环境内菌群与分泌物生化性质变化引起的常见阴道疾病，表现为正常阴道乳杆菌数量减少而代之以阴道加德纳氏菌等兼性厌氧菌、厌氧菌数量增加并伴随分泌物pH升高等重要生化成分变化的临床症候群。1915年newmen提倡用乳杆菌培养物治疗重症膀胱炎。1933年用人利用doderlleins菌治疗外阴阴道炎。80年代以后有大量利用乳杆菌治疗BV的实例。1999年，中国第一个用于治疗BV的德氏乳杆菌制剂获国家新药证书。,乳杆菌新药研究的目的,阴道炎是妇女常见病、多发病，临床上常以抗生素治疗，但效果不理想。抗生素的应用本身即可引起菌群失调，致使此病迁延不愈，给患者带来巨大痛苦。从微生态学的角度出发，通过生态制剂调整疗法扶正和保护阴道内的正常菌群的组成和比例，恢复其自然的抵抗外来菌侵扰的能力，促进其本身的自净作用是治疗此类疾病的一种方向。本研究目的是调查妇女阴道的菌群情况、阐明阴道菌群与妇女阴道疾病的关系、开发出一种用于防治妇女阴道细菌病及阴道菌群失调的微生态调节剂。,研究成果的意义,把德氏乳杆菌乳酸亚种作为阴道益生菌制剂，从立题、实验设计、立项到微生物学、微生态学、药效学、药代动力学、生产工艺及临床学研究，国外虽有报导，但正式把乳杆菌作为国家级类新生物制品用于阴道病的治疗，这还是首次。该项研究对健康阴道的微群落及微生态系(microecosystem)进行了比较全面和系统的研究。乳杆菌是阴道优势微种群，其他微种群如肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌及支原体均为劣势种群，研究指出在妊娠的早期、中期及晚期，阴道内的乳杆菌逐渐增加。阴道乳杆菌是妊娠过程中重要生理指标之一，并且是防御感染一个手段。本研究为阴道细菌病的防治提供理论指导。本研究成功的分离出一株产乳酸和过氧化氢的德氏乳杆菌并阐明其防治阴道细菌病的作用机制。为乳杆菌在防治阴道疾病方面提供了新的实例。本研究开发出一个用于治疗细菌性阴道炎、非特异性阴道炎或菌群失调性阴道炎及滴虫性阴道的国家生物制品新药。可大规模应用于临床为广大病人解除痛苦并可产生巨大的社会和经济效益。,国内外技术对比,据本成果完成后查新结果表明国外虽有多篇报导，但正式把德氏乳杆菌作为国家级生物制品新药用于阴道病的治疗，这还是首次。国内有关微生态调节剂治疗阴道细菌病的研究报道多数是本研究成果的报道。少数单位也在开展此方面的研究。2009年本制剂研究目前已获国家发明专利。,研究的简要过程,对不同年龄健康妇女的正常阴道菌群进行定性及定量分析;对各种确诊的阴道炎患者阴道菌群进行定性与定量分析;由健康阴道分离优势细菌种群，筛选生产菌种进行菌种分离、鉴定、生物特性、代谢产物、耐药性、代谢物、过氧化氢产生及质粒检测等;微生物学研究包括粘附、定植、生物拮抗、模型试验、安全试验、稳定试验和刺激试验;微生态调节剂的生产工艺研究包括种子、发酵、冻干和制剂产品稳定性及工艺稳定性等方面的研究;临床研究共进行500余例的人体观察;,本研究取得的主要成就（1）,该项研究对健康阴道的微群落及微生态系进行了比较全面和系统的研究。研究结果作为此项总课题的基础资料。研究结果证明，乳杆菌是阴道优势微种群，其他微种群如肠杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌及支原体均为劣势种群。研究结果表明，在妊娠的早期、中期及晚期，阴道内的乳杆菌逐渐增加。阴道乳杆菌是妊娠过程中重要生理指标之一，并且是防御感染一个手段。细菌性阴道炎(BV)、非特异性阴道炎(NSV)或菌群失调性阴道炎(DV)都出现一定的阴道菌群失调现象，其主要表现是乳杆菌减少或消失，其他种增多或比例失调。,本研究取得的主要成就（2）,作用机制研究阐明DM8909菌株与以下4个因素有关：1）粘附占位：DM8909菌株在阴道上皮细胞表面特异性占位，可以阻碍阴道其他种群对粘膜上皮细胞的粘附。DM8909在酸性环境下更易粘附于阴道上皮细胞表面。2）粘附抑制：DM8909菌株对其他阴道种群的粘附有抑制作用。可以将已粘附的大肠杆菌排斥掉。3）乳酸的产生：DM8909菌株能产生大量乳酸、降低阴道pH，抑制其他阴道种群，保持阴道清洁度。4）H2O2的产生：DM8909菌株能产生H2O2它具有“保护自己排除异已”的作用，是乳杆菌在阴道内保持优势地位的重要因素之一。,本研究取得的主要成就（3）,5药代动力学、药效学及安全性研究指出：“亿佰亿”是一个无毒、无害、安全且有效的生态制剂。6生产工艺研究表明：“亿佰亿”生产菌种DM8909菌株可以进行大罐发酵，并投入工业化生产。7临床研究证明：“亿佰亿”是一个局部及全身(肝、肾、血检查)无副作用的生态制剂。对细菌性阴道炎、滴虫性阴道炎均有较好的疗效。与现行的灭滴灵(对照组)比较，其疗效优于或不亚于灭滴灵，而且复发率低，无抗生素固有的耐药性、引起菌群失调及毒性反应等副作用。“亿佰亿”对细菌性阴道炎的总有效率达92.0%；而灭滴灵为83.7%，对滴虫性阴道炎的总有效率达96.7%。,8乳杆菌抗生素敏感试验天然耐药（与耐药性质粒无关）灭滴灵、SMZ-co、头孢甲氧霉素、克霉唑高度敏感麦迪霉素、庆大霉素、妥布霉素、青霉素、氨苄青霉素、链霉素、新霉素、四环素、痢特灵、氯霉素中度敏感多粘菌素、羧苄青霉素、丁胺卡那霉素,本研究取得的主要成就（4）,乳杆菌制剂对滴虫性阴道炎的治疗应用,1977年德国报道444例滴虫性阴道炎患者应用乳杆菌治疗一年后，96%人检查有92.5%临床完全治愈。1997年邓燕杰用乳杆菌制剂治疗滴虫性阴道炎起3个月治愈率高于甲硝唑。,阴道生态平衡与艾滋病的预防,许多报