耿婷婷-基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立(西北大学硕士学位毕业PPT)

基于金磁微粒的化学发光免疫学检测梅毒螺旋体抗体方法的建立,答辩人：耿婷婷导师：陈超崔亚丽,金壳层：纳米级金颗粒生物分子固定化容量大非共价偶联：Au-S相互作用疏水静电磁核心:超顺磁性，易于分离,一背景介绍,国家卫生部传染病法定报告：2005年全国发病人数第五位2007年全国发病人数第三位,年份,全国梅毒报告病例,首例梅毒病例在1979年重庆市报告,梅毒螺旋体,梅毒在我国已成为一个严峻的公共卫生问题，输血必检项目之一。,快速血浆反应素试验;假阴假阳梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验;方便、灵敏度低梅毒螺旋体特异性抗体酶联免疫吸附试验;灵敏度中等梅毒螺旋体核酸检测法；灵敏度高、昂贵梅毒螺旋体特异性抗体化学发光法检测;灵敏度高,金磁微粒为载体的化学发光酶免疫检测系统金磁：比表面积大；可自动化操作。化学发光：灵敏度高。,二.实验目的,1.建立磁酶免化学发光系统检测TP抗体2.血液中TP筛查，提高输血安全性3.血站自动化病原筛查,三.实验原理,化学发光,Luminol,H2O2,PIP,TMB底物,检测,吸光度与样品浓度成正比,Ag-Ab-酶复合物,四、实验设计及结果分析,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,1.TP抗原在金磁微粒表面的固定化,TP抗原包被前后的紫外吸收曲线,一步偶联：磁粒表面静电作用；疏水相互作用；半胱氨酸残基侧链的巯基与金的作用等。,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,2.优化免疫磁珠的包被时间1min、5min、10min、15min、20min、30min、60min,20min左右即可完成偶联反应选取30min为最佳包被时间,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,3.选择磁粒的浓度：10g/孔、30g/孔、50g/孔、100g/孔,过低：阳性值低过高：磁粒不透光影响发光信号选择：30g/孔,磁粒浓度（g/孔）,化学发光信号,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,4.优化封闭反应条件：,常用封闭条件为4C过夜，但实验中发现4C过夜并不适用于金磁微粒的封闭，达不到理想的封闭效果，阴性值较高。磁性微粒4C过夜时基本完全沉降在管底，不能充分反应导致。增加37C震荡2h，明显加强了封闭效果，阴性值较低。,（一）TP抗原免疫磁珠的制备,5.选择合适封闭剂1明胶、10小牛血清、0.5%BSA、5%奶粉、10%奶粉、5奶粉2小牛血清,（二）TP抗体的免疫学结合,双抗原夹心法检测,1.选择HPR标记抗原稀释液:20小牛PBST降低非特异性吸附：加入非特性蛋白加入表面活性剂,酶标抗体稀释液,吸光度值,（二）TP抗体的免疫学结合,（二）TP抗体的免疫学结合,2.优化免疫反应时间包被抗原、待检抗体、酶标抗原的结合是一个动态平衡反应，分别考察反应时间为10、15、25、30、40、50min时的检测结果,时间(min),吸光度值,阳性对照阴性对照,3.选择包被抗原浓度2.5g/mg、5g/mg、7.5g/mg、10g/mg、12.5g/mg、15g/mg,抗原包被量（g/mg）,发光信号,（二）TP抗体的免疫学结合,2.557.51012.515,4.选择HPR标记抗原的浓度,（二）TP抗体的免疫学结合,酶标抗体稀释度,抗原包被量,最佳工作条件:TP抗原包被量为5g/mg酶标抗原为1:3000稀释,（三）化学发光条件的优化,1.选择反应体系,Tris阳性阴性发光太弱CBS阳性阴性均发光,LuminolH2O2PIP,PBS阳性发光，阴性不发光PBST阳性发光，阴性不发光,（三）化学发光条件的优化,（三）化学发光条件的优化,2.缓冲体系中Tween-20浓度的影响,Tween20浓度(v/v),发光信号,（三）化学发光条件的优化,3.选择pH值,pH值,发光信号,（三）化学发光条件的优化,4.选择luminol浓度,Luminol浓度（mol/L）,相对光子数,（三）化学发光条件的优化,5.选择H2O2浓度,H2O2浓度(l/mL),发光信号,（三）化学发光条件的优化,6.选择PIP浓度,PIP浓度(mol/mL),发光信号,化学发光,Luminol,H2O2,PIP,Ag-Ab-酶复合物,（四）磁酶免化学发光方法的建立及评价,1.磁酶免化学发光法标准曲线测定,R2=0.9988,阳性血清梯度稀释,发光信号,（四）磁酶免化学发光法的建立及评价,将阳性血清梯度稀释，线性关系良好,y=10406x-4.619,（四）磁酶免化学发光法的建立及评价,2.磁酶免化学发光法与其他方法灵敏度的比较以金磁微粒为固相载体进行酶免检测，灵敏度提高2倍。结合化学发光检测，灵敏度可提高16倍。,（四）磁酶免化学发光法的建立及评价,3.磁酶免化学发光检测方法的精密度在线性范围内选取1:400稀释的阳性血清，重复测定11次，计算测定值的相对标准偏差RSD=5.5%。,磁分离化学发光免疫法检测阳性样品11次重复测定,相对光子数,五：全文总结,方法评价,标准曲线测定与其他方法灵敏度的比较法精密度的测定,全文总结,操作简单灵敏度高可自动化操作,致谢感谢陈超教授、