实验一――鸡胚成纤维细胞的培养

第一讲鸡胚成纤维单层细胞的制备与培养,预防兽医微生物组,实验目的,1.掌握无菌操作技术2.掌握细胞培养所需的仪器、设备3.了解细胞培养的相关理论4.掌握鸡胚成纤维细胞的原代培养技术,实验背景,原代细胞培养因具有细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具备二倍体的遗传性、来源方便等优点而广泛应用于病毒学、细胞分化、药物测试等试验。在禽类原代细胞培养中，鸡胚成纤维细胞(chickenembryofibroblast，CEF)得到普遍应用。CEF的培养是在一定的条件下，在体外模拟体内生理环境，使从体内取出的成纤维组织细胞生存、生长和传代，并维持原有组织细胞的结构和功能特性。与其他细胞相比，CEF相对容易获得，而且增殖能力强，适应性强，具有良好的耐受性，性状比较稳定，不易发生转化，所以被广泛地应用于分子和细胞生物学研究，以及疫苗的生产。,实验材料,预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液(0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液)；D-Hanks平衡盐溶液；灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个；巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪刀1把；碘酒，75酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。,实验设备,（1）37-CO2培养箱（2）倒置显微镜（3）超净台,实验步骤,1.取胚选择9-11日龄鸡胚于蛋架上，先后用碘酒和75%酒精消毒气室部外壳。用无菌眼科镊子击破该部位的蛋壳和卵膜，撕破尿囊膜和羊膜，并轻轻夹住鸡胚颈部取出鸡胚，放入无菌平皿中。,1气室2卵壳3卵黄囊4卵白5尿囊腔6绒毛尿囊7胚胎8羊水腔9胚胎外腔,2.剪碎用灭菌剪刀剪去鸡胚头部、腿部、翅膀和内脏，留下躯干组织。用D-Hanks液冲洗，除去血液后移入灭菌青瓶中，用灭菌剪刀尽量剪碎（1mm3小块），再用D-Hanks冲洗2次直至组织发白为止，然后将洗液上清吸弃。3.酶消化根据鸡胚组织块的多少，加入大约4倍量的胰酶(5-6mL)，于37温箱内消化15-20min，视其组织碎块变松散（聚合成一团、边缘毛样模糊）即可。轻轻吸出消化液，用D-Hanks洗1-3次。,4.吹打加适量1640营养液，用巴氏吸管反复吹吸数次，使细胞分散，制成细胞悬液。静置1分钟，使未冲散的组织块沉淀，吸出细胞悬液于20mL营养液中。重复3次收集细胞悬液，直至鸡胚发白为止。将纱布置于细胞瓶口，用吸管吸取细胞悬液滤过至细胞瓶中（注意不要将悬液溢出）。5.培养于37-CO2温箱内培养。24-48h后可长成单层细胞。,实验结果,1、观察原代细胞的形态和生长状况；2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细菌污染。,注意事项,1.切割组织块时务必要切成小块2.整个操作过程要严格保持无菌3.严格控制胰酶消化时间4.放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期和组别5.实验用品放回原处，摆放整齐,无菌操作的一般要求,用75酒精擦拭消毒双手。超净台台面应整洁，用0.1新洁尔灭擦净。打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用超净台时，打开风机，点燃酒精灯。,严格在酒精灯无菌范围之内操作。使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水瓶或试管内。操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。,拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾倒液体前后都