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凝胶色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：(1)保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息;(2)保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器;(3)固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长;（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10才能得以分离。,1分离原理分子筛效应一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。,分子筛是人造沸石或硅铝酸盐，具有严密而整齐的孔径网状晶体结构，它的网状多孔结构使得其具有较高的吸附容量，而且具有分子选择吸附的性能，通常用于吸附气体。,具有多孔的凝胶就是分子筛。各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。,综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况：一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙；二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙；三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。,对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子较小的可进入孔径较小但分布较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的多种成份在通过凝胶床时，按照分子量大小“排队，凝胶表现分子筛效应。,以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力（吸附、分配和离子交换等），因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱，不能被分离。比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长。,2.固定相化学惰性的多孔性材料，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。凝胶指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。,（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。,（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。,（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速1cm3s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。,3流动相在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。凝胶色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。,常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。,（二）色谱柱的重要参数柱体积：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因引柱体积又称“床”体积，常用Vt表示。外水体积：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用Vo表示。内水体积：因为凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，这就分间隙的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。不包括固体支持物的体积（Vg）。,峰洗脱体积：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液有体积，常用Ve表示。当使用样品的体积很少时，（与洗脱体积比较可以忽略不计），在洗脱图中，从加样到峰顶位置所用洗脱液体积为Ve。当样品体积与洗脱体积比较不能忽略时，洗脱体积计算可以从样品体积的一半到峰顶位置。当样品很大时，洗脱体积计算可以从应用样品开始到洗脱峰升高的弯曲点（或半高处）。,二、凝胶的种类及性质（一）交联葡聚糖凝胶（Sephadex）SephadexG交联葡聚糖的商品名为Sephndex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克千胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。SephadexLH-20，是SephadexG-25的羧丙基衍生物，能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。,（二）琼脂糖凝胶商品名很多，常见的有，Sepharose（瑞典，pharmacia），Bio-Gel-A（美国Bio-Rad）等。琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。,（三）聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶，是以丙烯酰胺为单位，由甲叉双丙烯酰胺交联成的，经干燥粉碎或加工成形制成粒状，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶。交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品为生物胶P（Bio-GelP），由美国Bio-Rod厂生产，型号很多，从P-2至P-300共10种，P后面的数字再乘1000就相当于该凝胶的排阻限度。（四）聚苯乙烯凝胶商品为Styrogel，具有大网孔结构，可用于分离分子量1600到40，000，000的生物大分子，适用于有机多聚物，分子量测定和脂溶性天然物的分级，凝胶机械强度好，洗脱剂可用甲基亚砜。,三、实验技术（一）层析柱层析柱是凝胶层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的直径大小不影响分离度，样品用量大，可加大柱的直径，一般制备用凝胶柱，直径大于2厘米，但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此外，直径加大，洗脱液体体积增大，样品稀释度大。分离度取决于柱高，为分离不同组分，凝胶柱床必须有适宜的高度，分离度与柱高的平方根相关，但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞，一般不超过1米。,分族分离时用短柱，一般凝胶柱长20-30厘米，柱高与直径的比较5:110:1，凝胶床体积为样品溶液体积的4-10倍。分级分离时柱高与直径之线为20:1100:1，常用凝胶柱有5025厘米。层析柱滤板下的死体积应尽可能的小，如果支掌滤板下的死体积大，被分离组分之间重新混合的可能性就大，其结果是影响洗脱峰形，出现拖尾出象，降低分辩力。在精确分离时，死体积不能超过总床体积的1/1000。,（二）凝胶的选择根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的SephadexG-200效果好，脱盐用SephadexG-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。,（三）凝胶的制备商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时，自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约时间，而且还可消毒，除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。,（四）样品溶液的处理样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去，如含脂类可高速离心或通过SephadexG-15短柱除去。样品的粘度不可大，含蛋白为超过4，粘度高影响分离效果。上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分离蛋白质样品的体积为凝胶床的1-4（一般约0.5-2ml），进行分族分离时样品液可为凝胶床的10，在蛋白质溶液除盐时，样品可达凝胶床的20-30。分级分离样品体积要小，使样品层尽可能窄，洗脱出的峰形较好。,（五）防止微生物的污染交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有:叠氨钠（NaN3）在凝胶层析中只要用0.02叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20时约为40；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。可乐酮Cl3C-C(OH)(CH3)2在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02。在微酸性溶液中它的杀菌效果最佳，在强碱性溶液中或温度高于60时易引起分解而失效。,乙基汞代巯基水杨酸钠在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0.01。在微酸性溶液中最为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。苯基汞代盐在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01。在微碱性溶液中抑效果最佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。,凝胶过滤色谱（gelfiltrationchromatography,GFC）：以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。凝胶渗透色谱（gelpermeationchromatography,GPC）：以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。,分离类型的选择,1根据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液一固、液一液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是20O2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用凝胶色谱法为最佳。,2根据溶解度选择弄清样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水并属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液一固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液一液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。,3根据分子结构选择用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液一液分配色谱、液一固吸附色谱；异构体用液一固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液一液分配色谱。,液相色谱分离类型选择参考图溶于水凝胶过滤色谱，水为流动相相对分子质量2000不溶于水凝胶渗透色谱，非水流动相同系物分配色谱不溶于水异构体吸附色谱样品分子大小差异凝胶色谱反相液一液色谱相对分子质量溶于水，不离解2000凝胶色谱，水为流动相碱阳离子交换色谱溶于水，可离解酸阴离子交换色谱溶于水，离子与非离子反相离子对色谱,柱的使用和维护注意事项避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。,选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。,经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要5075ml。硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。,反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100200ml四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。,保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。,高效毛细管电泳,一、高效毛细管电泳基本原理二、仪器装置三、影响柱效的因素及改进方法四、主要特点和应用,高效毛细管电泳仪器（1）,高效毛细管电泳仪器（2）,高效毛细管电泳仪器（3）,一、高效毛细管电泳基本原理,在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。,1.经典电泳分离法的不足所用分离柱的柱径大，柱较短，分离效率不高（远低于HPLC），温度影响大。高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进。,2.高效毛细管电泳技术上的重要突破,高效毛细管电泳在技术上采取了两项重要改进：采用了0.05mm内径的毛细管。毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。采用了高达数千伏的电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。,3.电泳现象与电渗流现象,电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移，速度电泳不同分子所带电荷性质、多少不同，形状、大小各异。一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内，受电场作用，样本中各组分按一定速度迁移，从而形成电泳。电泳迁移速度(v)可用下式表示：v=uE其中E为电场强度(EV/L，V为电压，L为毛细管总长度)。u为电泳淌度。,电渗流现象：玻璃表面存在硅羟基,pH3时,形成双电层，在高电场的作用下引起柱中的溶液整体向负极移动，速度电渗流。,4.分离过程,电场作用下，柱中出现：电泳现象和电渗流现象。,带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流两种速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反，电渗流电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,根据其分离样本的原理设计不同主要分