RNA提取及其定量分析.ppt

主要内容,一、RNA的提取二、逆转录体系,1、实验原理,2、注意事项,3、实验流程,三、荧光定量PCR,1.荧光定量PCR概念2.荧光定量PCR原理3.荧光定量PCR分类4.荧光定量PCR实验方法,一、RNA的提取,氯化锂沉淀法：SDS是一种去污剂，可以抑制内源RNA酶的活性，它不但可解聚核酸与蛋白质的结合，还可与蛋白质带正电荷的侧链结合，形成SDS蛋白质复合物而沉淀。4MLiCl可选择性沉淀RNA。Trizol法：Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍（强变性剂）配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。mRNA提取试剂盒:真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。,1.实验原理,1、内含二硫键，变性后会迅速重新折叠。2、不需二价阳离子激活。,一、RNA的提取,StructureofRNaseA,2.注意事项,一、RNA的提取,RNA酶：广泛存在：灰尘、人体唾液、实验器材表面。生物活性非常稳定：耐热、耐酸、耐碱。1、尽量避免外源性RNase污染A.操作环境空气洁净。带手套、口罩。实验台面等要彻底清理。B.用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）C.实验所涉及的离心管，枪头必须为RNA专用；处理RNA的移液器专用。D.玻璃器材、水都应该经过去RNase处理。对玻璃器材还应该进行高温烘烤。2、抑制内源性RNase活性：RNase抑制剂。,RNA分离的关键因素：避免RNA酶的污染。,2.注意事项,一、RNA的提取,3.1匀浆化作用,组织100mg，加1mlTRIzol,匀浆（要彻底，后转至EP管）组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管,将匀浆样品在1530C条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。,在加入氯仿之前（第1步），样品能于-60-70保存至少一个月。,每510106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1107细菌加1ml的TRIZOL，反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态。,一、RNA的提取,3.2分离阶段,剧烈摇动15S，室温2-5分钟（30C孵育）,加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）,4，离心12000g，15分钟,混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。,细胞,一、RNA的提取,细胞选择,贴壁细胞悬浮细胞,一、RNA的提取,3.3RNA的沉淀,加等体积异丙醇（约400-500l），混匀室温10分钟,转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中,4，离心12000g，10分钟，弃上清,RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。,一、RNA的提取,3.4RNA的洗脱,加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配），轻弹混合样品。,4离心7500g，5分钟,弃上清，空气中干燥5-10分钟（不能完全干燥）,RNA沉淀在75%乙醇中于2-8能保存至少一周，于-5-20能保存至少一年,一、RNA的提取,3.5RNA的再溶解,溶于DEPC水中至20l（10l-20l）（可在55-60水中，10分钟助溶）,DEPC水中溶解的RNA于-70，或置于冰上马上进行逆转录和PCR,DEPC水:是用1DEPC(diethylpyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水。经检测不含RNase、DNase和proteinase。,RNA的质量检验,未降解的RNA在琼脂糖凝胶电泳后应该能看到三条带：28SrRNA；18SrRNA；由tRNA、5.8SrRNA和5SrRNA组成的较模糊迁移较快的带，且28S的亮度应为18S两倍，且都没有弥散现象。如果孔附近还有明带，则表明产物中有DNA存在。,二、RNA定量技术,二、逆转录,1逆转录（reversetranscription）以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程。经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链，称为互补DNA（complementaryDNA,cDNA)。,二、逆转录,RNA：1000ug/CRNAH2O：11ul-VRNA5*First-StrandBuffer：4uldNTPMix：2uldT:1ulRevertraAce：1ulRnaseInhibition：1ulTOTAL：20ulPS:5*First-StrandBuffer里含有氯化镁,RNA：500ug/CRNAH2O：5.5ul-VRNA5*First-StrandBuffer：2uldNTPMix：1uldT:0.5ulRevertraAce：0.5ulRnaseInhibition：0.5ulTOTAL：10ul,2逆转录体系,二、逆转录,实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。5RTBuffer在溶解时，可能会出现白色沉淀现象，但不影响其品质。此时，请使用振荡器等仪器使其混合均匀，等完全溶解后再使用。RevertraAce是油性的，加之前应混匀，加之后要涡旋dNTPs加之前混匀。RevertraAce和RnaseInhibition用之前从-30冰箱中取出，使用过程中全程放冰上，用完即放回冰箱。,3注意事项,三、荧光定量PCR,1荧光定量PCR概念所谓定量PCR技术（real-timePCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。,2荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,X轴表示PCR循环数，Y轴表示扩增反应的荧光值,基线期：荧光背景信号阶段对数期：荧光信号指数扩增阶段平台期,恒定的Ct值,所谓Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。,2荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,2荧光定量PCR反应原理,三、荧光定量PCR,理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)n在扩增产物达到阈值线时:XCT=X0(1+Ex)CT=M(1)方程式(1)两边同时取对数得:logM=Ct*logX0(1+Ex)(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logM(3)LogX0浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率,XCT:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M,3.1特异性Taqman水解探针法,三、荧光定量PCR,Taqman荧光探针：一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。在当探针与靶序列配对进行延伸反应时，聚合酶的5外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生.,3.2非特异性SYBRGreenI染料法,三、荧光定量PCR,SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，可以根据荧光信号强度检测出PCR体系存在的双链DNA数量。,3.2非特异性SYBRGreenI染料法,三、荧光定量PCR,SYBRGreenI作用机理示意图,4实验方法,绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总RNA）中核酸的量（拷贝数、微克）。对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。相对定量是在相当量的试验组（样品A）和对照组（样品B）中一个靶基因的相对比率,三、荧光定量PCR,三、荧光定量PCR,4.1相对定量分析反应准备,物品：引物稀释：10倍：1ulF+1ulR+8ulddH2O20倍：1ulF+1ulR+18ulddH2O模板浓度：如果是首次实验,最好做浓度梯度，至少两个稀释度。一般而言，Ct值在1530范围内比较合适。ddH2OSYBRGREEN(避光)PCR专用八连管枪（量程合适10ul）枪头（进口枪头）仪器:定量PCR仪约时间、如果第一个做提前开机预热,4.2反应体系,三、荧光定量PCR,引物（上下游混合并已稀释好）4ul模板（稀释后的cDNA）1ulTaqDNA聚合酶dNTP二价阳离子（Mg2+优于Mn2+）一价阳离子（kcl）缓冲液SY