产气荚膜梭状芽孢杆菌检验

产气荚膜梭菌检验,食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌检验MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneExaminationofClostridiumperfringens,（魏氏梭菌）,目录1、概述2、生物学特性（菌体形态学特征、培养特性和抵抗力）3、毒素与分型4、培养基和试剂5、检验程序6、说明,1、概述产气荚膜梭状芽孢杆菌又称魏/卫氏梭菌分布：自然界广泛存在(创伤感染）。易污染食品：动物性食品原料食品加热后未及时冷却，所含耐高温而残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量繁殖，菌数可达数10万/g，食用前又未加热，则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是活菌数测定及证实试验。,2、生物学特性1)形态与染色G+(陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽胞的大杆菌大小：为(12)mX(210)m。芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的直径，有的菌株难形成芽胞。荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基内生长时可形成荚膜。,Clostridiumperfringens,/research/micimm/index.php,/research/Images/SarkerSlide.jpg,www.uni-ulm.de/./Diagnostik/Erreger/c_keim.htm,2)培养特性,*不严格的厌氧*普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。*适宜生长温度为3747。*生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。*在45高温下可进行快速分离纯培养，每培养34h传种1次，较易分离纯化。,ClostridiumPerfringensToxin,/./agents/AgentsBW_toxins.asp,肝片肉汤培养：大量产气，培养5h-6h变浑浊；牛奶培养基中生长：能够分解乳糖产酸，将酪蛋白凝固产生大量气体，冲散酪蛋白，使其成海绵状。庖肉培养基中培养：产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化。普通琼脂平板上培养：15h24h形成S型菌落，在营养不足或琼脂浓度高的平板上可形成锯齿状带放射条纹的R型菌落。,/course/fsc/441/resulex10.html,at45C，ClostridiumperfringensisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation。,鲜血琼脂平板生长：菌落周围出现双层溶血环，内层溶血完全，外层溶血不完全，好似靶状，菌落本身略带灰黄色至浅灰褐色，与空气接触30min后，有时可能逐渐变为灰绿色、甚至鲜绿色，这是本菌的特征之一。,Clostridiumperfringensshowsdouble-zonehemolysisonbloodagar.Notethesmallareaofbetahemolysis(completelysisofredbloodcells)surroundedbyalargerzoneofalphahemolysis(partialhemolysis).Theplateissittingonablacklabbench,www.cat.cc.md.us/./labmanua/lab16/bloodcp.html,ClostridiumperfringensGrowingonBloodAgar,/articles/01_02/Clos.,www.cat.cc.md.us/./labmanua/lab16/bloodcp.html,菌落周围出现乳光浑浊带，此反应能被本菌的抗毒素抑制。*由于发酵乳糖，菌落周围的培养基颜色发生变化*本菌不消化牛奶，不分解游离脂肪，菌落周围不出现透明环及虹彩层（肉毒梭菌可形成）。,www.sat.affrc.go.jp/./Cl_perfringens.htm,乳糖牛奶卵黄琼脂平板上培养：,3)生化特性*发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖及蔗糖，产酸产气，*液化明胶*还原硝酸盐为亚硝酸盐。*能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐的琼脂中形成黑色菌落,*发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓暴风雨式发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。,4）抵抗力A型与C型菌株的芽胞：耐热性强，煮沸13h，繁殖型菌体不耐热。,www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html,3、毒素、酶与分型毒素：产气荚膜梭菌能产生外毒素和肠毒素。外毒素：致死毒素、坏死毒素和溶血毒素，毒性不强不耐热。肠毒素：不耐热，60经10min即可破坏不耐酸，对碱有抵抗性，对胰蛋白酶等蛋白分解酶比较稳定。酶：纤维蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶等这些毒素和酶促使组织分解、坏死、产气、水肿及病变扩散和全身中毒等。,分型：根据毒素和抗血清中和试验将此菌分成A，B，C，D，E和F六个型。A型：最常见，引起气性坏疽和食物中毒；A型最早由WelchandNuttal(1892)分离，所以叫卫氏/魏氏梭菌C型：可引起肠炎。*对人致病的主要是A、C和F型*引起食物中毒的主要是A型,4、培养基和试剂4.1庖肉培养基产生大量气体，肉渣或肉块略带粉红，但不消化4.2亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）-能将亚硫酸盐还原为硫化物，在含亚硫酸盐及铁盐(含有柠檬酸铁胺)的琼脂中形成黑色菌落；前面分离培养和计数用,（SPS）,4.3液体硫乙醇酸盐培养基（FT）大量培养该菌用,4.4动力硝酸盐培养基-无鞭毛，不运动；还原硝酸盐为亚硝酸盐,4.5含铁牛奶培养基-发酵牛奶中的乳糖，使牛奶凝固，同时大量产气，凝块碎裂，即所谓暴风雨式发酵”/“暴烈发酵”，这是本菌的重要生化特征之一，也是鉴别的主要指标。观察2h，5h不发酵为阴性,IronMilkMedium.ItisamediumusedinMostProbableNumberanalysisofClostridiumperfringens.Whenplacedat45C,CPisvirtuallytheonlyorganismthatwillproducetheStormyFermentation(seenintherighttube).Thecoagulationofmilkfatformsaplugtherebyrestrictingoxygen(whichisnecessaryforthisstrictanaerobe).Stormyfermenationusuallyoccurswithin6to8hours,/course/fsc/441/resulex10.html,4.6卵黄琼脂培养基检查卵磷脂酶，本菌卵磷脂酶阳性，接种点（每个平板接种10点以上）的底部及其周围形成乳白色的浑浊带。4.70.1蛋白胨水稀释剂；4.8硝酸盐还原试剂:甲萘胺液和对氨基苯磺酸液；4.9革兰氏染色液。,www.pouch-hcho.co.jp/japanese/virus23.html,肉毒梭菌,对比,5、检验程序,计数30300个菌落的稀释倍数,活菌计数培养,检验程序续,36，1824h,36，24h,46,25h爆发酵,无,6、说明1活菌计数培养：1：10稀释的样品用蛋白胨水依次稀释至10-210-6倍，取1ml放入2个平板，分别加15mlSPS琼脂，于36培养24h，选取长有30300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。,/course/fsc/441/resulex10.html,2、证实试验(1)纯培养：由平板上任取10个黑色菌落，分别接种FT培养基，于(361)培养1824h，大量繁殖。(2)菌体形态和染色检验：用培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株有卵形芽孢，位于菌体中央或近端。,(3)检查动力和硝酸盐还原实验：用接种环(针)穿刺接种动力硝酸盐培养基，于(361)培养24h.-判断有无动力-产气荚膜梭菌无动力；-滴加硝酸盐还原试剂“甲萘胺液和对氨基苯磺酸液”各0.5ml，观察硝酸盐是否被还原-产气荚膜梭菌，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。（红色）,(4)牛乳乳糖发酵产气“暴发酵”试验：取生长旺盛的FT培养液1ml接种于含铁牛乳培养基，在46水浴中培养2h后观察有无“暴发酵”现象。5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，产酸凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴风雨式发酵”现象，但培养基不变黑。,(5)卵磷脂酶检查试验：用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每块平板至少可接种10点)，于厌氧培养，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围乳白色的混浊带。,3、菌数计算根据黑色菌落的计数和证实试验的结果，计算1g(ml)食品检样的含菌数。例如：104稀释