细胞免疫学技术

第十章免疫细胞学技术,第一节免疫细胞分离技术,1、自然沉降法2、聚合物加速沉降法明胶右旋糖酐PVP,一、白细胞分离,二、外周血单个核细胞的分离,d2c-m(X)V(X)=g18(X),利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法,形成密度梯度的介质,1.BSA2.聚蔗糖Ficoll3.泛影酸盐IsopaqueHypaque泛影葡胺（Urografin)4.硅胶颗粒聚乙烯吡咯烷酮,1、Ficoll分离法,分离介质：Ficoll-Hypaque原理：Ficoll-Hypaque密度：1.077主要材料：淋巴细胞分离液RPMI1640培养液离心管等肝素抗凝血分离过程：,结果：效果评价：得率纯度活力注意事项：密度的选择加样界面活力检查,2、Percoll分离法,d2c-m(X)V(X)=g18(X),c-m(X)=0,原理：主要材料：分离过程：结果：,(1)连续BSA密度梯度离心法,三、淋巴细胞分离技术,（一）淋巴细胞的纯化1、红细胞的去除低渗裂解法氯化铵裂解法2、血小板的去除3、单核细胞的去除,黏附贴壁法过柱吸附法磁铁吸附法,尼龙毛分离法,原理：聚酰胺纤维主要材料：RPMI1640、Hanks液尼龙毛柱待分离的材料分离过程：结果：,注意事项：1、尼龙毛与尼龙毛柱2、洗柱速度3、温度与pH值,（二）淋巴细胞亚群的分离,1.E花环沉降法2.尼龙毛分离法3.免疫吸附分离法4.免疫磁性微珠分离法5.流式细胞仪分离法,1、免疫溶解法,原理：抗Thy-1抗体主要材料：Hanks、补体、RPMI1640分离过程：一步法二步法结果：,注意事项：1、预实验2、对照组3、处理细胞的密度4、补体的来源5、缺点：,注意事项,1、盘化法分离细胞的使用范围2、直接法和间接法的比较3、包被用抗体可以反复使用4、包被抗体的瓶皿的保存5、加样体积,玫瑰花环分离法,1。E玫瑰花环分离法2。EA玫瑰花环分离法3。EAC玫瑰花环分离法,五、流式细胞分选术,免疫磁珠分离技术,(一)、原理：免疫磁性微珠直接法间接法分离细胞的方式：阳性分离（正选）阴性分离（负选）,瑞士Dynal公司：磁珠基因公司：磁式细胞分选器（magneticactivatedcellsorterMACS),CD34+造血干细胞分离试剂盒,试剂A1:为人IgG试剂A2:半抗原偶联的抗CD34单克隆抗体试剂A3:抗半抗原抗体和磁珠结合物,MiniMACSMACS正选柱其他：淋巴细胞分离液Hanks液,细胞分离过程：,制备外周血单个核细胞,108/300l磁标记抗体磁性分离细胞结果：细胞的纯度和活力95%,注意事项：标记要快速、低温小心淋洗细胞缓冲液要除气柱子使用前用4%BSA预处理,优点:1.细胞种类广2.分离纯度高3.分选方式灵活4.细胞活力好5.细胞处理量大缺点:费用大,评价:,四、吞噬细胞的分离和收集,单核细胞巨噬细胞1.巨噬细胞收集2.动物腹腔巨噬细胞收集,第二节淋巴细胞标志和功能检测,一、概述,淋巴细胞TBNK,T细胞表面标志,T细胞受体TCR簇分化抗原CDCD2CD3CD4/CD8其他MHCI类抗原有丝分裂原受体:PHA/ConA病毒受体,B细胞的表面标志,表面免疫球蛋白SIgMHC和CD抗原其他Fc受体补体受体丝裂原受体:LPS,NK细胞,自然杀伤活性细胞因子活化的杀伤作用ADCCCD16CD56,二.淋巴细胞表面标志的检测,特异性抗原的检测特异性受体的检测,T细胞表面主要CD抗原及其特异性,特异性抗原的检测,标志抗体:流式细胞仪ABC法红细胞致敏:花环试验,标记抗体,荧光,金银染色,酶免疫法亲和素-生物素法,间接免疫荧光法,荧光显微镜检测：淋巴细胞+相应单抗荧光素标记的二抗观察,A比值，相对值B.淋巴细胞纯度要求高C.主观影响较大D.普通显微镜和荧光显微镜交替使用,普通显微镜观察间接法:未标记抗体酶法(以酶作为抗原,制备抗体):APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶）桥联免疫酶染色法,免疫细胞化学法,APAAP（碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶）桥联免疫酶染色法,一抗二抗APAAP:,特点:抗原和抗体均未被酶标记,ABC(avidin-biotin-peroxidasecomplex)法,亲和素-生物素技术,ABC(avidin-biotin-peroxidasecomplex)法,一抗亲和素生物素生物素化二抗酶ABC,显色,特点:亲和素有4个与生物素结合的位点两者结合的亲和力比抗原抗体强100万倍,T细胞特异性受体的检测,Et花环试验Ea花环试验,原理：T-SRBCR+SRBCE花环（erythrocyte）特点：Et代表总T细胞，占60-80%，42小时；Ea代表T细胞一亚群，占20-40%，短时间温育(1)检测T细胞（2）用SRBC（3）E花环结合不牢固,特异性绵羊红细胞受体（E花环）,B细胞表面标志的检测,细胞表面抗原的检测细胞受体的检测,细胞表面抗原的检测,细胞,+,cAb,间接荧光酶免疫组化,细胞受体的检测,SmIg的检测c受体和补体受体的检测,SmIg的检测,可采用多价抗Ig,也可用抗各种Ig抗体，人外周血SmIgM最多酶免疫组化法（包括法）荧光免疫法:避免形成帽状结合物,c受体和补体受体的检测,EA花环EAC花环,原理E+A（antibody）EA复合物+B-FCREA花环,FC受体的检测（EA花环）,检测B细胞，但单核、巨噬细胞等也有此受体RBC可选牛、人、羊等均可IgG抗体,E+AEA复合物+CEAC+B-CREAC花环,补体受体的检测（EAC花环）,检测B细胞可选用牛、鸡等表面无FC受体的RBC避免EA花环，选IgM补体应新鲜、溶血能力低,T细胞功能的检测,T细胞增殖试验T细胞介导的细胞毒试验,T淋巴细胞增殖试验,原理：,淋巴细胞,DNA合成,分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,淋巴细胞转化的刺激物,非特异性刺激物PHA-T细胞ConA-T细胞PWM-TB细胞LPS-B细胞特异性刺激物：异种抗原同种组织抗原,形态法：刺激物淋巴细胞（4-6天）母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h）DNA合成期+3HTdR掺入收集细胞检测射线,检测方法,测定细胞内的3HTdR,T细胞介导的细胞毒试验lymphocytemediatedcytotoxicityLMC,靶细胞抗原,T细胞,观察杀伤活力,原理：,致敏CTL,靶细胞,方法,形态学方法：淋巴细胞+肿瘤细胞计数残留肿瘤细胞,同位素法：淋巴细胞（CTL）+含51Cr的肿瘤细胞,肿瘤细胞破坏51Cr释放测定射线,意义：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,B细胞功能的检测,B细胞增殖能力的试验B细胞抗体形成功能的检测,B细胞增殖能力的试验,抗IgM细菌脂多糖SAC的SPA,B细胞增殖,形态学,3HTdR掺入法,反向空斑形成试验:体外检测人类Ig分泌细胞的方法酶联免疫斑点法：,B细胞分泌功能检测,染色计数,离心取上清测LDH或AKP,离心取沉淀测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法,自然杀伤细胞的检测,靶细胞溶解,常用靶细胞:K562细胞株,趋化吞噬胞内杀灭作用,吞噬细胞功能的检测,中性粒细胞功能的检测,细胞运动功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测,细胞运动功能的检测,琼脂糖凝胶扩散法,白细胞吞噬功能的检测,12d全血等量菌液3730min推片、固定、染色、计数白细胞吞噬率,吞噬细菌的细胞数,200个中性粒细胞数,100,吞噬指数,200个粒细胞吞菌总数,200个中性粒细胞数,100,白细胞杀菌功能检测的检测,溶细胞法NBT还原法化学发光法,白细胞菌液,37培养,定时取定量菌液培养,计算菌落数,溶细胞法,中性粒细胞杀菌耗能代谢生成H+,四氮唑蓝(淡黄色),甲簪(蓝黑色),原理,操作,四氮唑蓝(NBT)还原试验,抗凝血+NBT应用液温育推片瑞士复染,意义,化学发光法:敏感,发光,中性粒细胞杀菌NADPH氧化酶激活过氧化离子,SOD,H2O2,髓过氧化物酶,鲁米诺,次氯酸和卤化物,杀菌,杀菌,巨噬细胞功能的检测,吞噬功能的检测巨噬细胞溶酶体酶的测定酸性磷酸酶测定非特异性酶的测定巨噬细胞表面受体的检测,受检细胞+颗粒性抗原(鸡红细胞等)涂片、染色、镜检吞噬率吞噬指数,吞噬功能的检测,酸性磷酸酶的测定,硝酸铅法-甘油磷酸钠酸性磷酸酶磷酸盐+硝酸铅磷酸铅+硫酸铵黑色的硫化铅,酸性磷酸酶不稳定,细胞涂片需先冷固定,处理不当,酶活性消失,封片后可保存,+,酸性磷酸酶的测定,偶氮法-萘磷酸钠酸性磷酸酶萘酚+磷酸盐+偶氮试剂棕红色,封片后保存时间短,+,非特异性酯酶的测定,-萘醋酸非特异性酯酶萘酚+醋酸+偶氮试剂棕红色,+,非特异性酯酶比较稳定,临床上常用,Fc受体EA花环C3b受体EAC花环试验,巨噬细胞表面受体的检测,第四节细胞因子及其受体测定技术,CytokinesCK,是指由活化的免疫细胞或非免疫细胞（如骨髓或胸腺中的基质细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞等）合成分泌的、能调节细胞生理功能、介导炎症反应、参与免疫应答和组织修复等多种生物学效应的小分子多肽，是除免疫球蛋白和补体之外的又一类分泌型免疫分子。,A：CK的产生和功能概况,B：CK发挥功能的模式,细胞因子检测方法学,生物学检测法免疫学检测法分子生物学检测方法,一、生物学测定技术,1、细胞增殖法：IL-2：CTLL-2IL-1：小鼠胸腺细胞细胞增殖检测：MTT法3H-TdR掺入法,2、靶细胞杀伤法：TNF敏感的肿瘤细胞：L929