细胞生物学实验技术(一)ppt课件VIP

.,动物细胞生物学实验技术,.,主要内容,第一节培养细胞的细胞生物学第二节细胞培养第三节显微镜知识第四节细胞生物学实验技术,.,第一节培养细胞的细胞生物学,.,主要内容,（一）体内、外细胞的差异,（二）体外培养细胞的分型,（三）培养细胞的生长和增殖过程,.,体外培养的细胞和体内细胞的比较相似：仍存在细胞和细胞、细胞和基质的相互关系单个细胞虽能生长繁殖,但不如群体细胞能力强，当相邻细胞接触，便导致运动停止细胞相互沟通生物信息的结果对细胞外基质仍有依存性差异：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不明显,.,细胞外基质存在于组织中，由细胞合成并分泌至胞外的成分，分布在细胞表面或细胞之间的大分子，包括纤维性成分(胶原蛋白、弹性蛋白和网织蛋白)、连接蛋白(纤维粘连蛋白、层粘连蛋白)和空间充填分子(主要为糖胺聚糖)等，其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用。这些物质构成复杂的网架结构，支持并连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动。,.,1影响细胞的存活、生长与死亡正常真核细胞，大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活，称为定着依赖性（anchoragedependence）。例如，上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。,.,2决定细胞的形状细胞呈单个游离状态时多呈球形。同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附时可表现出完全不同的形状。细胞外基质决定细胞的形状这一作用是通过其受体影响细胞骨架的组装而实现的。,.,3控制细胞的分化细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。例如，成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖，进行分化，融合为肌管。,.,4参与细胞的迁移细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向，并为细胞迁移提供“脚手架”。细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基质时诱导粘着斑的形成，粘着斑是联系细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。,.,（一）体内、外细胞的差异,体内：神经和体液的调节、细胞间相互影响,体外：缺乏动态平衡的稳定环境,发生的变化分化现象减弱形态功能趋于单一化一定时间后死亡或者转化获得不死性,.,体外培养的细胞仍具有研究的意义许多性状仍与体内相同如体外培养的心肌细胞仍可博动，细胞在培养中的表现，存在相应基因关闭开启引起的现象，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。,.,（二）体外培养细胞的分型,贴附型：大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按体内组织学标推判定,悬浮型：见于少数特殊的细胞，白血病细胞，骨髓细胞或免疫细胞，不需要细胞间和细胞与培养表面的接触。,.,贴附型细胞的分类,成纤维细胞型,上皮型细胞,游走细胞型,多型细胞型,.,成纤维细胞型梭型或不规则三角形，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。凡培养中形态与成纤维类似时皆可称为成纤维细胞。,.,.,上皮型细胞：,扁平不规则多角形，彼此紧密相连。生长时呈膜状移动，细胞很少单独行动。,起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,.,游走细胞型：散在生长，不连成片，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,.,多型细胞型：有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,.,（三）培养细胞的生长和增殖过程,.,培养细胞的生命周期,是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。,种类、供体的年龄等。,人胚成纤维细胞可传3050代，约150300个增殖周期，能维待一年左右，最后衰老凋亡（Apoptosis）。小鼠的胚胎成纤维细胞仅可传几代,供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；,肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。,当细胞发生遗传改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。,.,生命周期的三个阶段,原代培养期,传代期,衰退期,.,原代培养：从体内取出组织,分离出细胞、接种培养到第一次传代。,原代培养（PrimaryCulture）期,原代培养细胞与体内原组织细胞在形态结构和功能上相似性大。,特点细胞群是异质的（Heterogeneous）细胞克隆形成率（CloningEfficiency）低，即细胞独立生存性差。由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象,.,原代培养分为两种方法直接接种组织块由组织分离出细胞后接种,.,.,组织块接种：牛胎儿成纤维细胞,.,传代期：,原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。此期的持续时间最长。,在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。,为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代后早期冻存。,一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,.,衰退期：,增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。,少数情况下，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性质（Malignancy）。这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。,无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。,.,细胞的一代生存期,1潜伏期（LatentPhase）,2指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）,3停滞期（StagnatePhase）,.,1潜伏期（LatentPhase）,细胞接种培养后，先是悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。,接着细胞贴附于底物表面，称贴壁，,各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,经过延展过程变成极性细胞,可运动，基本无增殖。,细胞接种密度大时潜伏期短。,当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。,.,不同的细胞贴壁的时间不同,如巨噬细胞、成纤维细胞等粘附能力强,能在数分钟至数十分钟内粘附到固相表面如神经元细胞、羊水细胞，粘附能力弱,需要数小时乃至更长的时间才能粘附到固相表面可利用此特点（粘附：快、牢；慢、弱）分离、纯化细胞,.,.,贴附过程：3步贴附因子粘附细胞开始附着细胞进一步牢固附着伸展,.,细胞贴壁影响因素生物因素：血清、培养液中的促附着因子机械、物理等其他因素：流动：培养液流动可阻止细胞附着离心：促进附着低温：可抑制附着,.,加速细胞贴壁的措施,包被培养皿底面：对分化程度高、生长能力差的细胞可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质如:-通过其所带电荷先吸附培养皿底部,培养的细胞再与其结合。,血清内含有多种能够促进细胞粘附的成分,减少接种时细胞悬液的量，待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液,.,培养液中离子成分及其浓度如，培养液中的Ca含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展合适的培养温度,.,细胞铺展（伸展）(spread)进行生命活动的一种基本的生长特点或生长行为铺展状况制约细胞的分裂增殖活动铺展的过程细胞先由圆形变为圆饼形(放射状铺展细胞)逐渐铺开伸展成为扁平的极性细，铺展的越好与生长基质的表面接触面越大极性细胞就是细胞在体外的特征性细胞形态铺展状况与细胞的生长有密切关系只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行,.,2，指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）,是细胞增值最旺盛的阶段，是细胞一代中活力最好的时期,是进行各种实验最好的和最主要的阶段。,以细胞分裂指数（MitoticIndex：MI）作为判定细胞生长旺盛与否的重要标志。即每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，原代细胞分裂指数低，永生细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达3%5%。pH和培养液血清含量变动对细胞分裂指数有很大影响,.,2，指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）,接触抑制（ContactInhibition）由于细胞增殖而的相互接触，进而抑制细胞的运动和增殖，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。接触抑制是创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央爬行时,一旦上皮细胞互相接触,就停止分化和增殖。该现象就叫接触抑制。因此,创面上不会出现多余的皮赘。这也是一种十分巧妙和神秘的调控现象。,.,接触抑制（Contactinhibition）,细胞相互接触时，将停止增长；细胞停留在细胞周期的G0期；转化的细胞却可以继续生长导致细胞重叠堆积生长。,.,3停滞期（StagnatePhase）：,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期（Plateau）。,停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。,此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,.,第二节、细胞培养,.,主要内容,（一）细胞培养所需条件,（二）细胞培养所需用品,（三）细胞培养液,（四）细胞的原代、继代培养,（五）细胞的冻存和复苏,（六）细胞污染,.,（一）细胞培养所需条件,1营养需要,2细胞的生存环境温度:37O2CO2:5%CO2+H2OH2CO3H+HCO3-pH:7.2-7.4渗透压湿度,3无污染,4无毒,.,（二）细胞培养所需用品：,无菌间、超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯,CO2培养箱,倒置显微镜,液氮罐,自动双重纯水蒸馏器，纯水仪,耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管,.,1超净工作台(Hood):,A.水平流超净工作台(Horizontalairflow),B.垂直流超净工作台(Lateralairflow),C.层流空气超净工作台(Laminarairflow),.,水平流超净工作台背送风，但病毒是不实用的，容易对人有害,.,垂直流超净工作台,.,.,超净工作台的清洁维护：保持工作台上无死角，让空气得到充分过滤，即试验完毕后，将所有的用品收藏起来，工作台上只留有酒精灯及橡皮头。工作前和工作完毕都要用酒精擦桌面，如果桌面滴有培养液等物，实验结束后应先用水擦，然后用酒精再擦。还需定期检测工作台滤器过滤的效率。,.,整个接种操作应在近火焰处进行，且动作要迅速,正确错误,.,接种过程中尽可能达到悬空要求,防止操作带来的污染,正确错误,.,接种时不得用手接触瓶盖内壁或瓶口,正确错误,.,瓶盖朝上放，接种完毕后立即盖好瓶口,正确错误,.,2，CO2培养箱,CO2培养箱设定的条件为37，100%湿度，5CO2。,使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题,用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。,保持培养箱内空气干净。定期消毒（90，14h)。,箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,.,湿度以第二天第一次开门，能看到玻璃门上的水珠,.,3消毒设备：,A.高压消毒锅（Autoclave）：110C，15lb，20分钟，适合于橡皮、纸、布、塑料制品和液体（9lb，10分钟）等。消毒后必须在烤箱中低温烤干。,B.干热消毒箱：150-200C，2-3小时。适合于玻璃器皿、金属器械等。,C.酒精消毒：解剖器械、塑料器皿、动物皮毛等，酒精浓度为7595。,.,高压消毒锅,.,D.滤膜过滤：,正压过滤:蠕动泵通入培液；通入气体。,负压过滤：用水泵或油泵抽滤。,滤膜孔径为0.22m，为延长滤膜寿命可同时添加0.45m和1.2m滤膜。,.,滤膜滤器,.,两种：1，一次性滤器；2，买滤膜自己装（需要消毒）,.,4.蒸馏器与去离子纯水系统：1）用三蒸水，通过去离子纯水系统，电阻需达到170万欧姆以上。2）专门的去离子水系统5.倒置相差显微镜：需用相差镜头和滤光片，集光器的选择应与接物镜的放大倍数一致。,.,纯水系统,.,倒置相差显微镜1，物镜朝上2，工作距离大3，相差干涉,.,5，培养器皿,.,培养板与培养瓶,.,5，恒温水浴箱，血清灭活，细胞解冻,.,6，移液管,.,.,.,7，低速离心机,.,（三）细胞培养基,干粉培养基和液体培养基常用的培养基种类RPMI-1640（标准型）、DMEM-高糖（标准型）、DMEM-低糖（标准型）、McCoys5A、M199、F12等,.,Gibco干粉培养液,液体培养液,1，培养在使用之前需要加入的成分：血清、H2CO3,丙酮酸钠、抗生素等,.,Hyclone胎牛血清,Gibco胎牛血清,血清使用前要根据需要的量进行分装，避免反复冻融，血清保存要放置20,.,培养液的选择,没有一定的标准，有几点建议可供参考,选择培养这种细胞首选的培养液。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。,其它实验室惯用的培养液不妨一试，许多培养液可以适合多种细胞。,用多种培养液培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。,总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIMV培养基（SFM）。,.,血清使用注意事项,血清必须贮存于20-70，若存放于4，请勿超过一个月。,血清解冻步骤(逐步解冻法):-20或70至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由20直接至37解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。,热灭活（heat-inactivation）是指56,30分钟加热已完全解冻之血清。目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沉淀物显著增多，且会影响血清之品质。,勿将血清置于37太久，若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质,.,补体系统原指血清中引起免疫性细胞溶解（抗体包裹细胞溶解）的不耐热因子；现指至少由20种截然不同的血清蛋白组成的完整功能相关系统。补体系统主要的功能是通過在病原体表面的作用，破坏其细胞膜或者“调理”病原体表面供巨噬细胞吞食，此外还能引起发炎反应。加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。,.,凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沉淀物，因为会阻塞过滤膜。显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37中欲培养此“微生物“，但在37环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。,血清沉淀物,.,谷氨酰胺,L谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终确定。L谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。配制方法为：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mM的溶液，充分搅拌溶解后（应加温30），过滤除菌，分装小瓶，-20保存，使用时可向100ml培养液中加入0.5-2ml谷氨酰胺浓缩液，终浓度为1-4mM,.,酚红,大多数培养液中使用酚红作为pH指示橙色表示中性pH黄色代表酸性pH紫色表示碱性pH在一些特殊培养液中不含酚红因为已有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用，为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。,.,细胞消化液,由组织中分离细胞和细胞传代,常用的有胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)两种溶液，单独或混合使用,.,胰蛋白酶溶液主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散消化细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用,EDTA4Na溶液一种化学螯合剂，对细胞有一定的离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便常用工作液浓度为0.02%。,注意：使用EDTA处理细胞后，要用平衡盐液冲洗干净，因残留的EDTA会影响细胞生长,.,（四）细胞的原代和传代培养,.,鼠胎组织细胞原代培养,取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污切割：用PBS将取出的组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清消化、接种培养：加入0.25胰蛋白酶消化液（5-10倍量），与组织块混匀。置37水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入510ml细胞培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养,.,全量换液和半量换液换液时机的选择：培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多，pH值下降，营养液酸化变黄。细胞状态,细胞换液,.,细胞传代,原代细胞传代以便获得稳定的细胞株细胞系传代以得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续接触抑制营养枯竭将培养的细胞从培养器皿中消化下来，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的器皿中进行培养，即为传代培养细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同，在一代中，细胞培增36次,.,消化法传代培养步骤,.,(五)细胞冻存和复苏,冷冻保存要点冷冻过程要缓慢：缓冻速溶43060分钟-2030分钟-801618小时（或过夜）液氮长期保存或使用程序降温盒，每秒下降1冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：5x1062x107/ml。常用细胞冷冻保存液5%或10DMSO完全培养液10甘油完全培养液,.,冷冻细胞注意事项,冻存液配制:现用现配，DMSO是易燃物冻存液体积：要小，0.5-1ml冻存细胞数：与正常传代细胞数目要相当，避免复苏后细胞传代比例发生变化冻存速度：降温缓慢4C，1030min-20C，1-2h-80C，1hour过夜-196C，1-2year完善记录：冻存细胞名称，PD，冻存日期，冻存人，存放位置，其它特殊信息等,.,细胞冻存管，做好标记,.,.,细胞复苏,速融冻存细胞从液氮中取出后，立即放入37水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在1分钟内全部融化（不要超过3分钟）,解冻后的细胞可直接接种到含完全培养液中直接进行培养，24小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除DMSO,如果细胞对冷冻保护剂特别敏感解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液的培养瓶中,.,（六）细胞污染,细菌污染真菌污染细菌和真菌的清除支原体污染支原体的清除,.,细菌污染,细胞培养常见的污染最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,.,真菌污染,真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。,.,白色念珠菌（倒置显微镜下）,中间长梭型的是正在分裂的念珠菌,.,细菌和真菌的清除,使用抗生素抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。污染后清除用药需采用大于常用量510倍药物冲洗法，于加药后作用2448小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。,.,95以上是以下四种支原体：口腔支原体（M.orale）精氨酸支原体（M.arginini）猪鼻支原体（M.hyorhinis）牛莱氏无胆甾原体（A.laidlawii）危害：世界性问题，平均发生率达到11%能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达不能通过可视法对其进行检测对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染来源：操作环境不良操作人员的疏失实验器具不洁等已受污染的细胞已受污染的培养基、血清,支原体污染,.,荧光染色法电镜检查：扫描电镜、透射电镜支原体培养聚合酶链反应(PCR)法,支原体污染检测,.,细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,支原体污染表现,荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体,.,支原体的清除,支原体清除剂MRA（MycoplasmaRemovalAgent）处理法每4天换一次液，连续处理15天清洗纯化法细胞营养驯化优质细胞群的筛选细胞清洗反复离心洗涤原理：由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生，所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原