核酸类药物分析

核酸药物分析，第1节总结了第2节分析方法的应用实例，第3节总结了第1节。结构和分类的核酸药物可以通过帮助恢复正常代谢或干扰某些异常代谢来达到治疗疾病的目的。核酸是通过3，5磷酸二酯键聚合多个单核苷酸形成的生物大分子。单核苷酸的基本结构包括核苷和磷酸，核苷由含氮碱基(嘌呤碱基和嘧啶碱基)和戊糖通过糖苷键缩合而成。根据戊糖的类型，核酸可分为核糖核酸和脱氧核糖核酸。核酸和核苷酸药物是指具有药用价值的核酸、核苷酸、核苷和碱基及其类似物或衍生物。根据其化学结构和组成，可分为四类：核酸碱基及其衍生物，如硫鸟嘌呤、氟尿嘧啶、阿昔洛韦等。(2)核苷及其衍生物，如肌苷、利巴韦林和阿糖胞苷；(3)核苷酸及其衍生物，如三磷酸腺苷二钠、胞磷胆碱钠和环磷酸腺苷；多核苷酸，如寡核苷酸、核糖核酸、核糖核酸、抗肿瘤免疫核糖核酸等。阿昔洛韦的化学名称是9-(2-羟基乙氧基甲基)鸟嘌呤。化学结构式：药理作用：抗病毒药物。体外可抑制单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒等。(1)干扰病毒DNA聚合酶并抑制病毒复制；(2)在DNA聚合酶的作用下，它与生长中的DNA链结合，导致DNA链的延伸被打断。本品对病毒有特殊亲和力，但对哺乳动物宿主细胞毒性低。可溶性多核苷酸和核苷酸药物是磷酸盐，除了环磷酸腺苷外，可溶于水。核苷类药物在乙醇和乙醚等有机溶剂中溶解性差。一些核苷类药物溶于水(如利巴韦林)，而一些核苷类药物微溶于水(如肌苷)。基于核酸药物大多可溶于酸性或碱性溶剂，如氟胞嘧啶，并且容易溶于稀盐酸和稀氢氧化钠溶液。紫外吸收核苷酸的磷酸酯和戊糖没有明显的紫外吸收，而嘌呤碱基和嘧啶碱基等碱基具有共轭双键结构，在紫外区有明显的吸收。因此，多核苷酸、核苷酸和核苷与构成它们的碱基具有相似的紫外吸收光谱，最大吸收波长通常在260 nm左右。(3)酸碱核苷酸分子结构中的磷酸和戊糖是酸性的，其中磷酸更酸性，碱是弱碱性的含氮化合物，因此多核苷酸、核苷酸和核苷类药物是两性化合物。基于核酸的药物只有碱基，而且是碱性的。4在可水解核苷酸药物的分子结构中，磷酸和戊糖之间的酯键以及戊糖和碱之间的糖苷键将被水解。在相同的条件下，酯键将首先水解。在第二部分的分析方法中，所有种类的核酸药物都含有碱基并且具有弱碱性和紫外线吸收特性。多核苷酸、核苷酸和核苷类药物都含有戊糖；磷酸包含在多核苷酸和核苷酸结构中。因此，它们有一些常用的分析方法，如紫外分光光度法进行鉴别或含量测定。鉴别(1)戊糖的化学鉴别(1)地衣酚反应当核糖核酸、核糖核苷酸或核糖核苷与酸共加热时，水解形成的戊糖脱水成糠醛，然后与3，5二羟基甲苯(orcinol)反应，缩合成绿色化合物。使用铁盐或铜盐作为催化剂可以提高显色的灵敏度。地衣酚反应特异性差，戊糖有这种反应。绿色670纳米，(2)由二苯胺与酸热解产生的脱氧核糖核酸、脱氧核苷酸或脱氧核苷在乙醛存在下与二苯胺反应，产生在595纳米波长下最大吸收的蓝色化合物。核糖核酸和核糖核苷酸没有这种反应。蓝色595nm。2 .2磷酸识别核酸、核苷酸药物磷酸由加热水解产生嘌呤碱基的鉴定含有嘌呤碱基的核酸药物可以与氨水溶液中的硝酸银试液反应生成白色银盐，当暴露在光下时会变成红棕色。该反应是嘌呤碱的特征识别反应。元素、氟和氟胞嘧啶的识别含氟有机化合物如氟尿嘧啶和氟胞嘧啶在温和的热条件下暴露于强氧化剂如三氧化铬的饱和硫酸溶液时会产生氟化氢，腐蚀玻璃表面并导致硫酸溶液不均匀地涂覆在管壁上，导致类似于油垢的现象。硫代鸟嘌呤分子结构中硫元素5的鉴定硫在甲醇钠溶液中缓慢加热后会转化为硫化氢气体，使醋酸铅试纸变黑或变灰。分子结构中的巯基嘌呤也能与醋酸铅试液反应生成黄色沉淀。(2)光谱识别1。紫外吸收光谱法中碱基结构中的嘌呤和嘧啶环在紫外区具有特征吸收，可用于鉴别。如吸收系数、固定浓度下的最大吸收波长和吸光度、最小吸收波长等。红外吸收光谱法红外吸收光谱法主要分为标准图谱比较法或对照品比较法，中国药典主要采用标准图谱比较法。红外光谱具有叠加性，共存组分会改变待测组分的红外光谱。因此，红外吸收光谱通常用于鉴别纯度较高的生药。影响红外吸收光谱的因素很多，如样品制备方法、水分含量、晶型等。因此在鉴定时应严格按照规定绘制图谱。对于可能发生晶体转变的药物，应按规定进行重结晶后绘制图谱。例如，为了鉴别更昔洛韦，本产品的红外吸收图谱应与对照品的图谱一致。否则，将适量本品与对照品分别加水制成饱和溶液，过滤，取滤液置于10下过夜，待结晶、过滤、滤渣于105干燥后，再测定滤液。核糖核酸和脱氧核糖核酸钠的检测大多通过提取制备，寡核苷酸大多通过化学合成制备，核酸碱基、核苷和核苷酸药物大多通过酶水解、发酵和半合成方法制备。核酸药物的杂质检查包括一般杂质检查、特殊杂质检查和安全性检查。一般杂质检查主要包括氯化物、硫酸盐、重金属、砷盐、铵盐、铁盐、干燥损失、灼烧残渣等。安全检查主要包括细菌内毒素、异常毒性、无菌检查等。主要介绍原料或生产过程中引入的杂质、污染物或其他成分等特殊杂质。(1)多核苷酸药物的检查1吸收核糖核酸和脱氧核糖核酸钠大部分是从细胞或动物内脏中提取的，例如核糖核酸1是从健康猪的肝脏中提取的。某些蛋白质不可避免地被带入制备过程，而吸光度检查是为了控制核酸药物中的蛋白质含量。具体方法是配制一定浓度的测试溶液，分别在260 nm和280 nm波长处测量吸光度，要求吸光度比值不小于1.7。纯核糖核酸在260纳米和280纳米波长下的吸光度比值大于2.0，而脱氧核糖核酸的吸光度比值约为1.9。当样品中的蛋白质含量增加时，该比率将降低。检测核糖核酸中脱氧核糖核酸的原理：脱氧核糖核酸在酸性条件下与二苯胺反应，产生最大吸收在600纳米左右的蓝色化合物，而核糖核酸则没有。通过将吸光度控制在600纳米，可以控制脱氧核糖核酸的含量。当增色核酸分子解聚或断裂时，其发色团-碱基暴露，导致增强的紫外吸收。然而，其他杂质，如蛋白质，也有增色硫鸟嘌呤是以鸟嘌呤为原料制备的。具有与硫鸟嘌呤相似结构的杂质，如残留的原料、中间体和副反应产物，可能被带入最终产品，统称为“相关物质”。在这些杂质中，鸟嘌呤是一种已知的杂质，有一种参照物质，通过参照物质控制方法进行检查。其他杂质用主成分自控法检查，无校正因子。在生产含氯盐酸阿糖胞苷的过程中，由于成盐不完全或其他一些盐酸杂质，即氯含量，药物中盐酸的含量可能会发生变化。因此，其纯度可以通过测定氯含量来控制。3氟尿嘧啶原料药中的氟含量也可以通过氟含量来控制。核酸药物结构中嘧啶和嘌呤碱基的含量测定；它们呈微碱性，可以用非水碱法测定。其共轭结构具有一定的紫外吸收，其含量可通过测定最大吸收波长的吸光度来确定，也可通过高效液相色谱紫外检测器来确定。当核酸原料药的杂质较少时，可用非水碱法或紫外分光光度法进行定量。当杂质较多时，应采用具有分离和分析能力的高效液相色谱。(1)非水碱性滴定原理1核苷或碱基衍生物、类似物等药物呈弱碱性，在水溶液中用酸滴定时没有明显的跳跃，难以获得满意的测定结果。然而，在冰醋酸溶剂中，弱碱性基团的相对碱强度显著增加，这可以用高氯酸滴定剂定量滴定。这些药物的含量可以根据消耗的高氯酸滴定剂的体积来计算。以更昔洛韦的含量测定为例：取本品约0.15 g，准确称量，加入40 ml冰醋酸，加热溶解，冷却，加入1滴结晶紫指示剂液，用高氯酸滴定剂(0.1 mol/L)滴定至溶液变绿，用空白试验校正滴定结果。每1毫升高氯酸滴定剂(0.1摩尔/升)相当于25.52毫克c9h13n5o4。注意：该方法准确度高，精密度好，广泛应用于弱碱性原料药的含量测定。然而，这种方法受到许多因素的影响，必须注意以下问题。(1)水在冰醋酸中呈碱性，可与高氯酸反应，因此反应系统中不应有水。(2)由于溶剂-冰醋酸易挥发，膨胀系数大，高氯酸滴定剂的浓度受温度和储存条件的影响很大。滴定和校准之间的温差对高氯酸滴定剂的浓度有很大影响。当温差小于10时，滴定剂的浓度经校正后可用于定量计算。如果温差超过10，滴定剂的浓度应重新校准。高氯酸滴定剂的浓度校正公式如下：(3)冰醋酸溶剂的挥发和弱碱性杂质的存在可能会对测定结果造成干扰。因此，在这种方法中必须进行空白校正，即不添加试验物品，使用相同的方法。空白应从获得的结果中扣除。(4)电位滴定法和指示剂法是常用的终点指示方法，但指示剂终点的颜色变化需要用电位滴定法来测定。用紫外分光光度法测定嘌呤碱和嘧啶碱的紫外吸收特性，不仅可用于鉴别，也可用于此类药物的含量测定。采用紫外分光光度法中的吸收系数法测定中国药典 (2015版)收载的巯基嘌呤、氟尿嘧啶和别嘌呤醇原料。(3)高效液相色谱法大多数核酸药物可以用常规的反相高效液相色谱法进行分离和测定，但当某些结构中带有极性基团的核酸药物用常规方法进行分离时，效果较差，应改用一些特殊的高效液相色谱法，如离子对色谱法或离子交换色谱法。核仁的磷酸基团用离子对色谱法测定中国药典 (2015版)中环磷酸腺苷、三磷酸腺苷二钠和胞磷胆碱钠的含量。离子对色谱是向流动相中加入适量的反离子，使待测组分以解离状态形成离子对，增加它们在非极性固定相上的分布，从而改善它们的色谱保留和分离行为。核苷酸是酸性物质，因此它们的离子对试剂通常是季铵盐阳离子试剂，如四丁基溴化铵和四丁基氢氧化铵。离子对色谱的影响因素很多，包括反离子的性质和浓度、流动相的组成、酸碱度和离子强度等。这需要仔细选择。环磷酸腺苷：色谱条件的测定及十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的系统适用性试验：以磷酸二氢钾和四丁基溴化铵的混合溶液为流动相；检测波长为258纳米。取约10毫克环磷酸腺苷对照品，加入5毫升水使其溶解，加入1毫升1摩尔/升的盐酸溶液，水浴加热30分钟，冷却，用氢氧化钠试液调至中性，用水稀释至每1毫升含约0.2毫克的溶液，注入20微升至液相色谱仪。 环磷酸腺苷峰与相邻杂质峰的分离度应符合要求，根据环磷酸腺苷峰计算，理论塔板数不应小于2000，拖尾系数应小于1.4。 核酸药物的结构通过离子交换层析含有含氮的碱性基团和多羟基糖苷，其中一些还以磷酸盐的形式存在。这些基团将与常规C18色谱柱上残留的硅烷醇羟基发生氢键吸附，导致峰拖尾和柱压升高，不利于分离和测定。利用这些药物在适当条件下的可电离性，使用离子交换树脂(如磺化交联苯乙烯-二乙烯基共聚物)作为固定相填料，利用离子交换原理进行分离可以有效改善拖尾问题。中国药典从2005版开始，用阳离子交换色谱法测定利巴韦林的含量，结果明显改善。利巴韦林含量的测定。磺化交联苯乙烯-二乙烯共聚物的氢阳离子交换树脂用作色谱条件和系统适用性试验的填料。以水(用稀硫酸调节酸碱度至2.50.1)为流动相；检测波长为207纳米。根据利巴韦林峰计算，理论塔板数不应小于2000。在离子交换色谱中，水缓冲溶液通常用作流动相，有时加入适量的有机溶剂，如甲醇或乙醇，以提高样品的分辨率或溶解度。第3节应用示例1。巯基嘌呤巯基嘌呤是一种次黄嘌呤类似物，通过抑制核酸合成发挥抗肿瘤作用。该药物是含有一种结晶水的巯基嘌呤。该产品主要是通过化学合成制备的。巯基嘌呤主要由氰乙酸乙酯合成。在加热的无水乙醇和乙醇钠溶液中，氰基乙酸乙酯首先用硫脲环化生成2-巯基-4-氨基-6-羟基嘧啶，再经亚硝酰化和还原得到2-巯基-4，5-二氨基-6-羟基嘧啶，然后在活性镍的作用下通过消除巯基得到4，5-二氨基-6-羟基嘧啶，再用甲酸环合成6-羟基嘧啶，然后在吡啶溶液中于118与五硫化二磷反应得到巯基嘌呤鉴别(1)本品溶于乙醇后，与醋酸铅乙醇溶液反应生成巯基嘌呤铅黄沉淀。(2)巯基嘌呤分子上的巯基(sh)与强氧化剂浓硝酸反应，氧化成6-嘌呤亚磺酸，再氧化成黄色的6-嘌呤磺酸，然后与氢氧化钠试液反应，生成黄棕色的6-嘌呤磺酸钠。(3)巯基嘌呤与氨试液反应生成铵盐。溶解度增加，溶液变得清澈，然后与硝酸银试液反应，形成巯基嘌呤的银絮状沉淀，并带有小的s(2)检查1.6-羟基尿6-羟基尿是巯基嘌呤的合成中间体，其结构只有一个不同于巯基嘌呤的取代基：一个是羟基取代，另一个是巯基取代。如果精制不完全，会有残留，影响巯基嘌呤的安全使用。中国药典 (2015年版)利用两者在紫外吸收光谱上的差异，通过紫外-可见分光光度法控制6-羟基嘌呤的量。巯基嘌呤在325 nm处有很强的紫外吸收，而6-羟基嘌呤的最大吸收波长是255 nm和325 nm，因此6-羟基嘌呤的量可以通过规定在255 nm和325 nm处的吸收率不超过0.06来控制。硫酸盐产品生产过程中可能会产生硫酸盐杂质。中国药典 (2015年版)用于盐酸溶液中，不能与氯化钡反应产生浊度来控制硫酸盐杂质。3.水分对于含有结晶水的药物，巯基嘌呤的水分含量约为10.6%。根据中国药典 (2015年版)，要求用费歇尔法测定含水量，含水量应为10.0