食品微生物技术.ppt

第二章食品微生物技术-纯培养和显微技术,微生物的基本特点：,小！,在绝大多数情况下都是利用微生物的群体来研究其属性；,微生物的物种（菌株）一般也是以群体的形式进行繁衍、保存；,培养技术在微生物学中具有重要意义！,在研究中所使用的微生物培养群体：,培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体,混合培养物：含有多种微生物的培养物；纯培养物：只有一种微生物的培养物；,通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果,纯培养技术是进行微生物学研究的基础！,Culture、isolate,微生物个体微小的特点也决定了显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。,微生物的基本特点：,小！,第一节微生物的分离和纯培养,从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。,一、无菌技术（aspetictechnique),用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；其自身不污染操作环境,Inoculationincubation,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,试管、瓶子、培养皿等,1887年，RJPetri发明,Petridish,高温干热灭菌,高压蒸汽灭菌,试管、瓶子、培养皿等,常用的灭菌方法：,1、微生物培养的常用器具及其灭菌,常用的器具：,2、接种操作,无菌操作：,火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行,无菌操作：,在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行,1.紫外线波长250-270nm2.化学消毒5%的石碳酸，甲醛熏蒸3.超净工作台,用经过灭菌的工具（移液枪、吸管、接种环、接种针）在无菌条件下，移接含菌材料与高压蒸汽灭菌的培养基上，这个过程称无菌操作。,无菌操作程序,灭菌,接种（inoculation)：将微生物纯种或含菌材料转移到培养基上的过程.工具：接种针、接种环、接种钩；无菌吸管、移液枪,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基；固体培养基；半固体培养基；,二、用固体培养基分离纯培养,培养基：,液体培养基；固体培养基；半固体培养基；,琼脂,柯赫（RobertKoch）的助手WHeese和他的夫人FranHeese,二、用固体培养基分离纯培养,菌落（colony）：,单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体（P13）,众多菌落连成一片,菌苔（lawn）,不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,二、用固体培养基分离纯培养,使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：,稀释！,微生物四大类菌的分离和培养,二、用固体培养基分离纯培养,1、稀释倒平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！,使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,二、用固体培养基分离纯培养,3、平板划线法,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,厌氧罐,厌氧手套箱,厌氧罐,厌氧手套箱,二、用固体培养基分离纯培养,4、厌氧微生物的分离,稀释摇管法,三、用液体培养基分离纯培养,0.05,0.05+0.0025+0.004,=0.975,稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。,例如：若同一稀释度的试管中有95%表现为不生长，则生长的试管中仅含一个细胞的几率为：5%；含二个细胞的几率为：0.25%；含三个细胞的几率为：0.004%,在有细菌生长的试管中得到纯培养的几率为97.5%,四、单细胞（孢子）分离,一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；,操作难度与细胞或个体的大小成反比；,五、选择培养分离,抑制大多数其它微生物的生长；,使待分离的微生物生长更快；,使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。,微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：,使待分离的微生物生长“突出”；,直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。,五、选择培养分离,1.利用选择平板进行直接分离,待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制,高温下培养：分离嗜热细菌；,培养基中不含N：分离固氮菌；,培养基加抗生素：分离抗性菌；,五、选择培养分离,1.利用选择平板进行直接分离,待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物,颜色反应：分离特定的菌株；,牛奶平板：分离蛋白酶产生菌；,五、选择培养分离,2.富集培养,从自然界中分离到所需的特定微生物,特定的环境条件,仅适应于该条件的微生物旺盛生长,待分离微生物在群落中的数量大大增加,六、二元培养物,培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。,病毒和宿主细胞；,纤毛虫、变形虫和粘细菌；,2.3微生物观察技术,细菌菌落形态细菌的菌落有其自己的特征，诸如湿润、较光滑、较透明、较粘稠、易挑取、质地均幻以及菌落正反面或边缘与中央部位的颜色一致等。对无鞭毛、个体能运动的细菌尤其是各种球菌来说，形成了较小、较厚、边缘极其圆整的菌落。对长有鞭毛的细菌来说，其菌落就有大而扁平、形状不规则和边缘多缺刻的特征，有荚膜的细菌，其菌落往往十分光滑，并呈透明的蛋清状，形状较大。产芽胞的细菌，因其芽胞引起的折光率变化而使菌落的外形变得很不透明或有“干燥”之感，并因其细胞分裂后常连成长短状而引起菌落表面租糙、有褶皱感。,放线菌菌落形态,放线菌获得其特有的与细菌不同的菌落特征：干燥、不透明，表面呈紧密的丝绒状、上有层色彩鲜艳的干粉；菌落和培养基的连接紧密，难以姚取；菌落的正反面颜色常常不一致，以及菌落边缘培养基的平面有变形现象等等。,酵母菌的菌落,菌落与细菌的相仿，但由于细胞比细菌的大，细胞内有许多分化的细胞器，细胞间隙含水量相对较少，以及不能运动等特点，因此菌落较大、较厚、外观较稠和较不透明。表面湿润，粘稠，易被挑起，多为乳白色，少数呈红色。,霉菌菌落,菌落形态较大，质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取，菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致等。,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,（参见P19）,基本要求：,基本方法：,生活态休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,七、微生物的保藏技术,2.3显微镜和显微技术,几个基本概念：,放大分辨率反差,被观察物越小，放大倍数应越大，否则难以看清！,能辨别两点之间最小距离的能力,被观察物区别于背景的程度,被观察物区别于背景的程度,与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是显微技术。,一、显微镜的种类及原理,1.普通光学显微镜,复式显微镜,一、显微镜的种类及原理,1.普通光学显微镜,光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？,如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？,目镜：1020；物镜：100；总放大倍数10002000；,使用油镜，即在100物镜和载玻片之间滴加香柏油；,0.5l分辨率（最小可分辨距离）=nsinq：光波波长n：玻片与物镜间介质的折射率：为物镜镜口角的半数,1.普通光学显微镜,1.普通光学显微镜,0.5l分辨率（最小可分辨距离）=nsinq,q为物镜镜口角的半数，它取决于物镜的直径和工作距离,1.普通光学显微镜,0.5l分辨率（最小可分辨距离）=nsinq,N：玻片与物镜间介质的折射率,空气(n=1.0)、水(n=1.33)、香柏油(n=1.52)、玻璃(n=1.54),普通光学显微镜又称明视野显微镜其照明光线直接进入视野，属透射照明。,一、显微镜的种类及原理,2.暗视野显微镜,一、显微镜的种类及原理,3.相差显微镜,4.荧光显微镜,一、显微镜的种类及原理,4.荧光显微镜,一、显微镜的种类及原理,一、显微镜的种类及原理,5.透射电子显微镜；6.扫描电子显微镜,一、显微镜的种类及原理,5.透射电子显微镜；6.扫描电子显微镜,一、显微镜的种类及原理,7.扫描隧道显微镜,培养物、纯培养物、无菌操作、菌落、菌苔稀释倒平板法、涂布平板法、平板划线法选择培养分离、富集培养稀释法、菌种保藏TEM、SEM、STM、AFM0.5分辨率（最小可分辨距离）=nsin,2.4杀菌技术,灭菌（sterilization）采用强烈的理化因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。消毒（disinfection）采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。化疗（chemotheraphy）即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,2.5微生物菌种保藏技术,在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。,理想的菌种保藏方法应具备的条件,(1)经长期保藏后菌种存活健在；(2)保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,微生物菌种保藏技术,(1)冷冻干燥或真空干燥保藏；(2)超低温或在液氮中冷冻保藏；(3)转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。,2.1冷冻保藏,冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。,冷冻保藏种类,一、普通冷冻保藏技术(-20)二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80)三、液氮冷冻保藏技术,普通冷冻保藏技术(-20),将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管肉，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5-20的普通冰箱(-20)中。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力12年。,应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。,二、超低温冷冻保藏技术(-60一-80),要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；2用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3加入等体积的20甘油或10二甲亚砜；4混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70超低温冰箱中保藏。,如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。,三、液氮冷冻保藏技术,(一)冷冻保护剂在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10、二甲亚砜5。所使用的甘油般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。,(二)液氮冷冻保藏微生物菌种的步骤1待冷冻保藏菌种悬液的制备(1)从生长斜面制备菌悬液：每一斜面加入5ml含10甘油的营养液体培养；用巴氏吸管吹吸斜面制成孢子及菌体细胞悬液；0.5lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，,(2)从浸没培养物制备菌悬液：在浸没培养液中加入等体积20%无菌甘油；轻轻振荡混匀培养液，如果菌体絮凝较紧，则需先用玻璃珠打散；0.5-lml分装玻璃安瓿或液氮冷藏专用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精喷灯封口；将所有封好的安瓿置于5冰箱中3min，以使细胞和悬浮培养基之间达到平衡。,2控速冷冻(1)将安瓿或液氮瓶置于铝盒或布袋中，然后置于一较大的金属容器中；(2)将此金属容器置于控速冷冻机的冷冻室中；(3)以1-2/min的致冷速度降温，直到温度达到相对温度之上几度的细胞冻结点(通常为-30)；(4)补加一定量的液氮至系统中，使细胞在冻结点时尽可能快地发生相变；,(5)细胞冻结后，将致冷速度降为1/min，直到温度达-50；(6)将安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-)96)或气相(-156)中保存。如果无控速冷冻机，则一般可将安瓿或液氮瓶置于一70冰箱中冷冻4h，然后迅速移入液氮罐中保存。,(三)复苏1从液氮罐中取出所需的安瓿，立即置于冰浴中；2迅速将安瓿置于37-40水浴中，并轻轻摇动以加速解；3用巴氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接入琼脂斜面上。,2.2冻干保藏,冷冻干燥的基本方法：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，目前国内常用脱脂乳和蔗糖，国外尚有运用动物血清等的。大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。而且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输。,培养物的冻干过程,(二)操作步骤1启动冷冻干燥器的致冷单元。当冷凝器的温度达到-40时启动真空泵，使真空度达到2.674.00Pa。2将冷冻槽置于歧管之下方。槽中装入23体积的异丙醇，然后插入温度计及可调温控仪降温探头打开降温探头控制醇浴温度在-40，这过程约需30min。3每支斜面加入2ml20的脱脂乳，然后用巴氏吸管将斜面上的菌苔吹打下制成孢子或菌体均悬液，最终菌株浓度一般要求在106CFUm1用细菌浸没培养物来保藏时，加入40的脱脂乳，混合制成含106CFUml的均悬液。,4取下安瓿上的棉塞，然后用lml移液管分装安瓿(0.2ml瓿)，重新塞好棉塞。5轻轻振荡安瓿，以使细胞重新悬浮。将安瓿与歧管相联后迅速置于醇浴中，然后调节温控装置。使细胞悬液迅速冻结。,615min后，将歧管与真空泵相通。7维持-40的醇浴温度90-120min，然后调节温控装置。使醇浴温度上升至-10，维持2h。8关掉可调温控装置的降温探头，让醇浴温度上升至室温(25)9在冷冻干燥的最初4h内应定期测真空度，在安瓿置于真空下后1h内，真空度必须达到13.33Pa，并于菌悬液接近干燥时逐渐降到2.674.0Pa。,10在真空状态下，让安瓿保存在冷冻干燥机中至少1