蛋白质药物的PEG化学修饰PPT课件VIP

.,1,蛋白质药物的PEG化学修饰胡涛,中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,.,2,1.迅速被体内酶降解2.肾小球过滤清除3.抗原抗体反应4.溶解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,.,3,体外聚乙二醇修饰（PEG化）,(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤(2)阻碍蛋白酶的降解作用(3)屏蔽药物的免疫位点(4)增加药物在体液中的溶解度(5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH3(-O-CH-CH)n-OH,.,4,生物医药生物能源生物材料生物化学品其它产品,生化工程（生物化学工程，BiochemicalEngineering）,.,5,目录,PEG修饰的国内外研究进展PEG修饰剂的研发PEG修饰方法PEG修饰工艺的优化PEG修饰产物的质量控制,.,6,一、PEG修饰的国内外研究进展,.,7,国际上PEG修饰技术的研究进展,美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作甲氧基PEG的应用美国Enzon公司美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司美国Shearwaters公司各种PEG修饰剂的生产商美国罗氏、先灵宝雅、安进PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。,.,8,国内PEG修饰技术的研究进展,国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000中国科学院重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010PEG修饰血红蛋白：I期临床（中科院过程所、凯正公司）PEG修饰G-CSF：III期临床（格兰百克）,.,9,修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF）延长半衰期修饰人肿瘤坏死因子消除副作用修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra）延长半衰期修饰牛胰核糖核酸酶（RNase）提高抗肿瘤活性修饰超氧化物歧化酶（SOD）提高半衰期修饰天冬酰氨酶（Aspartase）克服免疫原性提高半衰期修饰人干扰素（IFN）提高半衰期修饰血红蛋白（Hb）血液代用品修饰胰岛素提高半衰期,我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作,.,10,二、PEG修饰剂的研发,.,11,Sc-PEG专利分析,以PEG-OH为原料的必然途径,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH+光气+NHS,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N+NH2G-CSF,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF,O,单链修饰：,(SC-PEG),.,12,Roche公司的长效干扰素产品专利分析,同样是以PEG-OH为原料的必然途径,双链修饰：,.,13,新的修饰策略,采用新方法制备新的修饰剂,以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利,CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N+NH2G-CSF,单链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSF,O,(CM-PEG),.,14,我们的策略,以PEG-COOH为原料的必然途径,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,O,双链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH+Lysine,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-O-N,+NH2IFN,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-NH,IFN,.,15,1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功,取得的主要进展,.,16,聚乙二醇修饰剂产品,.,17,三、药用蛋白的PEG修饰方法,.,18,创新技术（反应器技术和产物移走技术）,振荡反应器,流加反应器,缓释反应器,固相反应方式,膜耦合反应方式,双水相反应方式,Q.Yun,R.Yang,T.Chen,J.Bi,G.Ma,ZSu.J.Biotechnology,2005,118:67-74,中国发明专利，申请号200510114930.0中国发明专利，申请号0410029577,1.修饰反应器设计PEG-pellet反应器,.,19,2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白,.,20,固相吸附法与液相吸附法的比较,1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白；3峰：多修饰蛋白,.,21,PEG-INF的制备过程,G-CSF,PEG-G-CSF,3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白,.,22,粒细胞集落刺激因子(G-CSF),MW:18.8kd(174aminoacids)pI:6.1,1thiol,1N-terminal,4lysines,Halflife:5h,Weeklyinjection:7times,.,23,三批PEG30-rhG-CSF产品的制备,取得的主要进展,PEG化重组人生长激素，批产量1-10g；PEG化降纤酶，批产量6000支；环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支,PEG化G-CSF,2L修饰反应器计算机程序控制批产量3g生产周期10天,.,24,修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平,生产规模产品质量批次稳定性,123,1,2,3,1,2,3,(A),(B),(C),以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例：(A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱(B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱(C)三批产品的园二色检测图谱,.,25,4.引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白,(2)PEGylation,S,NH,+,(1)Thiolation,HS-(CH2)3-C-NH-Hb,N,O,O,PEG,-S-(CH2)3-C-NH-Hb,O,PEG,N,O,2-iminothiolane,NH2-Hb,.,26,Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化,Hemospan-MP4,PhaseISwedenStatus:CompletePhaseIb/IISwedenStatus:CompletePhaseIISwedenStatus:CompletePhaseIIUSAStatus:EnrollmentCompletePhaseIIIEuropeStatus:EnrollmentComplete,.,27,该PEG修饰产物的凝胶过滤分析,.,28,四、PEG修饰工艺的优化,.,29,PEG修饰反应参数的优化,建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分子反应动力学，优化反应时间优化反应的pH值优化PEG与蛋白的摩尔比优化反应体系,.,30,蛋白分子的修饰反应动力学,WeijunLi,ZhiguoSu.Quantitativelyinvestigatingmonomethoxypolyethyleneglycolmodificationofproteinbycapillaryelectrophoresis,J.Biochem.Biophys.Methods.2004，59:65-74,.,31,PEG修饰的位点反应动力学,.,32,PEG醛修饰药用蛋白的优化反应,.,33,单修饰产物的分离纯化,P1P2,.,34,分离产物分析,P1凝胶过滤分析,.,35,膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白,.,36,五、PEG修饰产物的质量控制,.,37,IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白,1,2,3,4,+,-,Iodinestain,Comassiebluestain,SDS-PAGE,IEF,1:Marker,2:HbA,3:-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb5:(Propyl-PEG5K)6-Hb,1:HbA,2:-Hb3:(Propyl-PEG5K)6-Hb4:(Propyl-PEG5K)6-Hb,.,38,RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段,.,39,质谱分析胰蛋白酶切片段,MALDI-TOF/TOF分析PEG修饰位点在Val-1(),.,40,PEG修饰蛋白的结构鉴定,圆二色光谱鉴定,荧光光谱鉴定,.,41,RP-HPLC分析PEG修饰蛋白,.,42,蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利，ZL01141745.5制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利，ZL02120740.2带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利，ZL031100736.8聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途,中国发明专利，ZL200310113367.6重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利，ZL200410029577.1一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利，ZL03105003.4一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利，ZL99106228.0一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利，ZL99106229.9一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利ZL00123696.2分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利ZL01136190.5.血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品及其制备方法,中国发明专利，ZL03109622.0,蛋白质修饰国家发明专利11项（已授权）,PEG修饰的SCI论文,QYun,TChen,GZhang,JBi,GMa,ZSu.Anovelpolyethyleneglycolderivativesuitableforthepreparationofmono-PEGylatedprotein.BiotechLett,27,213-217,2005QYun,RYang,TChen,JBi,GMa,ZSu.ReproduciblepreparationandeffectiveseparationofPEGylatedrecombinanthumangranulocytecolony-stimulatingfactorwithnovel“PEG-pellet”PEGylationmodeandion-exchangechromatography.JBiotech.2005,118:67-74QYun,MHe,WXing,JBi,GMa,ZSu,Anoveltetrafunctionalreagentforsimultaneousintramolecularandintermolecularcross-linkingofbovinehemoglobin,BiotechLett26:1359-1363,2004.XLi,FMeng,GMa,ZSu,Asimpleandefficientmethodforsynthesisofcarboxymethylatedpolyethyleneglycol.JChemRes,Inpress.JZhang,YZhao,ZSu,GMa,SynthesisofMonomethoxyPoly(ethyleneglycol)withoutDiolPoly(ethyleneglycol),JApplPolymSci,105,37803786(2007).JZhang,ZSu,GMa,SynthesisandCharacterizationofHetetotelechelicpoly(ethyleneglycol)swithaminoacidatoneendandhydroxylgroupatanotherend,JApplPolymSci,inpress.CZheng,JBi,GMa,ZSu,PolyethyleneGlycolImprovesConjugationofBovineHemoglobinandHumanSerumAlbumininaControlledRati