基因工程的操作步骤.ppt

1.2基因工程的基本操作程序,二、基因表达载体的构建,三、将目的基因导入受体细胞,四、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,一、目的基因的获取,1.基因的结构,2.目的基因的概念,3.目的基因的获取的方法,1.基因的结构,（1）原核生物基因结构,编码区,非编码区,非编码区,编码区上游,编码区下游,编码蛋白质,调控遗传信息的表达,（调控程序）,AATGTGCACGTAGTTAGTTACACGTGCATCAATC,启动子,终止子,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,ATGTGCACGTAGTTA,TACACGTGCATCAAT,RNA聚合酶,AUGUGCACGUAGUUA,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。,RNA聚合酶:能够识别启动子上的结合位点并与其结合的一种蛋白质.,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，它能阻碍RNA聚合酶的移动，并使其从DNA模板链上脱离下来，使转录终止。,编码区,非编码区,非编码区,（能编码蛋白质）,启动子,终止子,（2）真核与原核生物基因结构的比较,外显子,内含子,编码蛋白质,（不能编码蛋白质）,相同点：都是由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区。,不同点：原核细胞基因的编码区是连续的；真核细胞的编码区是间隔的，不连续的。,真核生物基因结构,外显子：真核细胞基因DNA中的编码序列，这些序列被转录成RNA并进而翻译为蛋白质。内含子：真核细胞基因DNA中的间插序列，这些序列被转录成RNA，但随即被剪除而不翻译。,2.目的基因的概念,主要是指编码蛋白质基因，也可以是一些具有调控作用的因子。,例如：与生物抗逆性相关的基因，与生物优良品质相关的基因，药物和保健品相关的基因，与毒物降解相关的基因，以及与工业所需要酶相关的基因。,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、人胰岛素基因等。,3.目的基因的获取的方法,（3）用化学方法直接人工合成目的基因,（1）从基因库中获取目的基因,（2）应用PCR技术扩增目的基因,（1）从基因库中获取目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念,基因组文库和cDNA文库的主要区别,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,基因文库和部分基因文库的慨念：,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库。,基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库。,基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库。如：cDNA文库。,基因组文库的建立方法,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与运载体连接,导入受体菌中储存（基因组文库）,目的基因,分离,部分基因文库的建立方法,mRNA,反转录酶,单链DNA,合成,双链DNA（cDNA）,载体,插入,导入,受体菌群（cDNA文库）,分离,目的基因,cDNA合成过程,第一步：反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步：核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步：以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。,12.06.2020,13,基因组文库和cDNA文库的主要区别,小,大,无,有,无,有,某种生物的部分基因,某种生物的全部基因,可以,部分基因可以,怎样从基因文库中找到我们所需要的目的基因,根据目的基因的有关信息，例如，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基因。,（2）应用PCR技术扩增目的基因,定义：,原理：DNA复制,PCR是多聚酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术，在短时间内大量扩增目的基因,DNA分子热变性（在9095OC时，解旋，双链分开温度降低又结合成双链）因此，在PCR技术中不需要解旋酶（与复制不同之在处),仪器：,PCR扩增仪（自动调控温度的仪器）,条件：,有一段已知的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物，脱氧核苷酸，酶等。,过程：,a.DNA热变性（9095OC)：,b.复性或退火（5560OC)：,c.延伸（7075OC)：,d.重复a.b.c步骤：,双链DNA模板在热的作用下，氢键断裂形成单键DNA,系统温度降低，引物结合到互补DNA链上，形成局部的双链DNA,在Taq酶作用下，合成与模板互补的DNA子链，形成双链DNA,每重复一次，目的基因增加一倍,PCR扩增为指数形式扩增2n(n为扩增循环的次数），在短时间内扩增大量目的基因。,(3)用化学方法直接人工合成目的基因,蛋白质氨基酸序列mRNA的核苷酸序列目的基因序列目的基因针对：基因比较小，核苷酸序列又已知,推测,化学合成,思考：,不具有，缺少非编码区(启动子、终止子）和非编码序列（如内含子），要人工构建。,人工合成的目的基因是否具有完整基因结构的基因？,推测,1.作用：,二.基因表达载体的构建核心,IMN,2.组成：,使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代。,同时使目的基因能表达和发挥作用。,(3)终止子：是使转录在需要的地方停止,(4)标记基因：是鉴别受体细胞中是否含有目的基因从而将含有目的基因的细胞筛选出来,(2)启动子：是RNA聚合酶识别和结合部位,(1)目的基因,不同受体细胞，目的基因导入受体细胞的方法不同，基因表达载体的构建有所差异。,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口两个黏性末端,两个切口获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,基因表达载体的构建,12.06.2020,20,寻根问底：,将生物的所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,有人采用总DNA注射法进行遗传转化：即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体细胞，没有进行表达载体的构建。,这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体细胞。此法目前争议颇多，严格来说不算基因工程。,资料:,科学家在培育抗虫棉时，起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入抗虫基因启动子，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入抗虫基因终止子，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资料证明：载体构建组成要完整,三、将目的基因导入受体细胞,1.转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的工程,2.常见转化方法：,农杆菌转化法：双子叶植物和裸子植物。,（1）将目的基因导入植物细胞,基因枪法：单子叶植物。,花粉管通道法,（3）将目的基因导入微生物细胞感受态细胞法。,（2）将目的基因导入动物细胞显微注射法。,特点:,农杆菌转化法：,（1）将目的基因导入植物细胞,能感染双子叶植物和祼子植物,对大多数单子叶植物没有感染能力,过程：,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,适用生物：,双子叶植物、祼子植物。,Hind限制性酶,目的DNA,Ti质粒,苏云金杆菌,构建表达载体,Bt毒素蛋白基因,DNA连接酶,T-DNA(可转移-DNA),知识拓展,农杆菌转化法的过程：,花粉管通道法：,将目的基因导入植物细胞,操作方法：,特点：,在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含目的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞,十分简便经济,例：,转基因抗虫棉,基因枪法：,利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法,操作方法：,金属粒：,将目的基因导入单子叶植物细胞,钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.64um。,适用：单子叶植物,细胞类型：,操作程序：,_显微注射法：,（2）将目的基因导入动物细胞,发育成新性状动物,移植到子宫或输卵管,培养成早期胚胎,显微注射,取受精卵（体内或体外受精）,提纯含目的基因表达载体,受精卵,常用法：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,大肠杆菌,Ca2+处理获得感受态细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,_感受态细胞法,（3）将目的基因导入微生物细胞,例：,若通过基因过程生产人的糖蛋白可以用大肠杆菌作为工程菌吗？,答：不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成，而内质网和高尔基体存在真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含这两种细胞器。,以酵母菌作为工程菌可以吗?,答：可以，酵母菌为真核生物（真菌类）。,四目的基因的检测与鉴定检查是否成功,导入过程完成后，全部受体细胞都能摄入重组DNA分子吗？,真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。,目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？,不一定，需要检测,1.检测方法：,分子杂交技术：,（1）DNA分子与DNA分子的之间杂交,（2）DNA分子与RNA分子的之间杂交,（3）蛋白质分子（抗原与抗体）之间杂交,2.个体生物学水平的鉴定：,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,1.检测,转基因生物的DNA,探针,15N,15N,14N,14N,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,基因探针：,放射性同位素等标记的DNA分子,方法：,DNA分子杂交技术,变性,变性,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因。,变性,方法：,DNA分子杂交技术,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,探针,15N,15N,转基因生物的mRNA,14N,14N,如果显示出杂交带，就表明待测样品目的基因已经转录。,提取,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法：抗原-抗体杂交,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,证明：提取蛋白质与Bt毒素蛋白质一样,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,2.鉴定个体生物学水平的鉴定,（1）多细胞个体,抗虫、抗病结种实验，活性比较实验,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,（2）单细胞生物,1、有关基因工程的叙述中，错误的是()A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来B、限制性内切酶用于目的基因的获得C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,课堂练习,2、下列属于获取目的基因的方法的是()利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取利用PCR技术利用DNA转录人工合成A.B.C.D.,课堂练习,3、有关基因工程的叙述正确的是（）A、限制酶只在获得目的基因时才用B、重组质粒的形成在细胞内完成C、质粒都可作为运载体D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,4、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）A、人工合成目的基因B、目的基因与运载体结合C、将目的基因导入受体细胞D、目的基因的检测和表达1A2D3D4C,培养,培养,导入,含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌,含有氨苄青霉素的完全培养基,不能存活,Ca2+处理细胞形成感受态细胞,检测,（培养不具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的农杆菌）,具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,不具有氨苄青霉素抗性基因的农杆菌,完全培养基,含有氨苄青霉素的完全培养基,证明：目的基因已导入,存活,脱分化,组织培养,脱分化,导入植物细胞通过组织培养产生新个体,再分化,移植,个体生物学水平的鉴定,如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达,导入植物细胞,组织培养,再见,存活的大肠杆菌,培养,培养,质粒来源：,大肠杆菌,含有氨苄青霉素的完全培养基,含有四环素的完全培养基,人工改造质粒,（选择具有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因农杆菌）,质粒,知识拓展,Hind限制性酶,目的DNA,质粒,构建表达载体,四环素抗性基因由于目的基因插入而失活，形成只具有氨苄青霉素抗性基因,DNA连接酶,人类胰岛素的基因,培养,培养,培养,导入,含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌,含有氨苄青霉素