第二章蛋白质结构与功能PPT课件

.,1,蛋白质的结构与功能,第二章,StructureandFunctionofProtein,.,2,第二章蛋白质结构与功能,第一节蛋白质的分子组成第二节蛋白质的分子结构第三节蛋白质结构与功能的关系第四节蛋白质的理化性质及其分离纯化,.,3,概述,蛋白质（protein）是生命的物质基础。蛋白质是由DNA编码的氨基酸组成的。,4,蛋白质的重要性：,1.含量大：占人体固体成分的45%2.分布广：遍及全身各组织细胞。3.种类多：人体内有10万余种。自然界有100万之多。4.功能繁（复）杂：每种蛋白质都有其特异功能。,蛋白质是生命的物质基础，一切生命现象都离不开蛋白质。,.,5,蛋白质的分子组成,第一节,.,6,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘。,.,7,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数6.25100,1/16%,.,8,一、氨基酸（aminoacid）,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，除甘氨酸外，均属L-氨基酸。,氨基酸是蛋白质的基本组成单位。,.,9,（一）氨基酸的一般结构,中心一个碳原子-C连接一个氨基基团-NH2一个羧基基团-COOH一个氢原子-H一个不同的R基团-侧链,.,10,L-氨基酸和D-氨基酸,蛋白质中只存在L-氨基酸,.,11,非极性疏水性氨基酸极性中性氨基酸酸性氨基酸碱性氨基酸,（二）氨基酸的分类,.,12,.,13,1.非极性疏水性氨基酸,.,14,2.极性中性氨基酸,.,15,3.带正电荷的碱性氨基酸,.,16,4.带负电荷的酸性氨基酸,.,17,胱氨酸,二硫键的形成,.,18,记忆口诀,甘、丙、缬、亮、异，三、四碳烃基。丙、丁羟丝、苏。（半）胱、蛋含有硫。酸有天冬、谷；碱有精、赖、组。苯、酪、色、脯环；中性天、谷胺。,19,1.组成蛋白质的编码氨基酸只有20种。2.除G外，其他编码氨基酸均为L-型。3.P为环状亚氨基酸。4.含羟基氨基酸有：S、T、Y。5.含硫氨基酸有：C、M。6.芳香族氨基酸有：F、Y、W。7.支链氨基酸有：V、L、I。8.酸性氨基酸有：D、E。9.碱性氨基酸有：R、K、H。,要点：,.,20,（三）氨基酸的理化性质,1.两性解离及等电点,氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,.,21,在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,等电点(isoelectricpoint,pI),.,22,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性离子,阳离子,阴离子,.,23,2.紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,.,24,3.茚三酮反应,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,.,25,二、肽,*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）肽(peptide),氨基酸通过肽键缩合而成的化合物称为肽。,.,26,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,.,27,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,.,28,多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,.,29,氨基末端（N末端）：多肽链中有自由氨基的一端羧基末端（C末端）：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸(ser-gly-tyr-ala-leu),.,30,先写骨架NCC，,再写氨羧两末端；,然后配平酰胺键，,最后才是侧链上。,.,31,肽单元（peptideunit）,参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元。,.,32,肽键(C-N)具有部分双键的性质,.,33,绝大多数肽单元中C1和C2在平面所处的位置为反式（trans），即在连接它们的肽键的相反方向。,顺式(cis)肽单元和反式(trans)肽单元,.,34,（二）天然存在的活性肽,1.谷胱甘肽(glutathione,GSH),.,35,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,.,36,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),2.多肽类激素及神经肽,.,37,3.抗生素肽,抗生素肽是一类能抑制或杀死细菌的多肽。如短杆菌肽A、短杆菌素S、缬氨霉素（valinomycin）和博来霉素（blemycin）等。,.,38,.,39,蛋白质的分子结构,第二节,.,40,蛋白质的结构层次,.,41,第二节蛋白质的分子结构,.,42,定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的数目及排列顺序，包括二硫键的数目和位置。,一、蛋白质的一级结构(primarystructure),主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,.,43,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,目录,牛胰岛素的一级结构,.,44,二、蛋白质的二级结构(secondarystructure),主要的化学键：氢键,.,45,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋(-helix)-折叠(-pleatedsheet)-转角(-turn)无规卷曲(randomcoil),.,46,（一）-螺旋,目录,.,47,-螺旋要点呈右手螺旋（棒状）螺旋一圈含3.6个氨基酸残基，螺距0.54nm。螺旋稳定靠氢键，氢键方向与螺旋长轴平行R侧链对螺旋的形成和稳定有影响。,.,48,二、-折叠反平行-折叠和平行-折叠,.,49,-折叠要点呈伸展、锯齿状结构。有顺向平行和反向平行两种构象。折叠的稳定靠氢键。R侧链对折叠形成、稳定有影响。,.,50,（三）-转角和无规卷曲,-转角,无规卷曲是用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。,.,51,（四）超二级结构（模体motif）,指在多肽链内顺序上相互邻近的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成规则的二级结构聚集体。,.,52,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,锌指结构,.,53,三、蛋白质的三级结构(tertiarystructure),疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。,主要的化学键是次级键,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的整体排布。,（一）定义,.,54,目录,.,55,纤连蛋白分子的结构域,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。,.,56,细胞表面蛋白CD4分子4个相似结构域,.,57,肌红蛋白(Mb),血红素,铁原子,.,58,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,四、蛋白质的四级结构(quaternarystructure),蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。,.,59,血红蛋白的四级结构,链,链,血红素,.,60,五、蛋白质的分类,根据蛋白质的分子组成进行分类,根据蛋白质形状和空间构象进行分类,.,61,根据蛋白质功能进行分类,酶蛋白,调节蛋白,根据蛋白质分布进行分类,运输蛋白,结构蛋白,.,62,蛋白质结构与功能的关系,第三节,.,63,一、蛋白质一级结构与功能的关系,一级结构是空间构象和功能的基础,.,64,（一）一级结构是空间构象的基础,.,65,有活性,无活性,有活性,.,66,蛋白质的空间结构除一级结构和溶液环境为决定因素外，大多数蛋白质的正确折叠还需要一类称为分子伴侣的蛋白质参与。,.,67,分子伴侣,分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。,*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。,*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。,*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中保证二硫键的正确形成起了重要的作用。,.,68,（二）一级结构是功能的基础,相似的一级结构具有相似的功能，不同的一级结构具有不同的功能。,不同种属来源的胰岛素氨基酸序列的高度同源性决定了它们都具有调节血糖功能。人类和黑猩猩的细胞色素c一级结构相同和猕猴相差1个氨基酸。,.,69,促肾上腺皮质激素和促黑激素有共同的一段氨基酸序列，因此ACTH有较弱的促黑色素生成作用。,.,70,（三）一级结构改变与分子病,案例：镰刀状红细胞性贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,.,71,.,72,（a）正常红细胞（b）镰型红细胞,.,73,二、蛋白质空间结构与功能的关系,目录,空间结构是功能的基础,.,74,（一）蛋白质的功能依赖于特定的空间结构,胰岛素原转变成胰岛素,.,75,肌红蛋白与血红蛋白的结构,（二）血红蛋白的空间构象变化与结合氧,.,76,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合，Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,.,77,肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线,.,78,协同效应(cooperativity),蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响其中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。如果是促进作用则称为正协同效应(positivecooperativity)如果是抑制作用则称为负协同效应(negativecooperativity),.,79,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,.,80,变构效应(allostericeffect),配体与亚基结合后引起亚基构象变化的效应称为变构效应。,.,81,（三）蛋白质空间结构改变与疾病,蛋白质构象病：因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病（proteinconformationaldiseases）。,.,82,案例：克-雅氏(CJD)疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,.,83,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病。,.,84,朊病毒病,已发现的人类朊病毒病有：库鲁病（kurudisease）、脑软化病（GSS）、纹状体脊髓变性病或克-雅氏病（Creutzfeldt-Jakobdisease,CJD）、新变异型CJD（newvariantCJD,nvCJD）或称人类疯牛病和致死性家族性失眠症（fatalfamilialinsomnia,FFI）。动物的朊病毒病有：牛海绵状脑病或称疯牛病（bovinespongiformencephalopathy,BSE）、羊骚痒症（scrapie,SC）等。,与朊病毒蛋白构象相关的疾病统称为朊病毒病。,.,85,第四节,蛋白质的理化性质及其分离纯化,.,86,（一）两性电离及等电点,一、蛋白质的理化性质,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,.,87,（二）蛋白质的胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜,.,88,水化膜,溶液中蛋白质的聚沉,.,89,（三）蛋白质的变性与沉淀,1、蛋白质的变性(denaturation)在某些理化因素的作用下，蛋白质中维系其空间结构的次级键（甚至二硫键）断裂，使其空间结构遭受破坏，造成其理化性质的改变和生物活性的丧失。,.,90,造成变性的因素如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等。,.,91,应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,.,92,若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性。,蛋白质的复性(renaturation),.,93,.,94,2、蛋白质沉淀蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。,.,95,3、蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。,.,96,（四）蛋白质的光谱吸收及呈色反应,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,1蛋白质的光谱吸收,.,97,2.蛋白质的呈色反应,茚三酮反应(ninhydrinreaction)蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,.,98,酚试剂呈色反应是最为常用的蛋白质定量方法（Lowry法）,.,99,二、蛋白质的分离和纯化,蛋白质的各种理化性质和生物学性质是提取与纯化的依据,.,100,（一）改变蛋白质的溶解度,常用方法有：盐析有机溶剂沉淀调节pH改变温度等,.,101,盐析(saltprecipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,.,102,丙酮沉淀,使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,.,103,（二）根据蛋白质分子大小不同的分离方法,常用方法：离心超滤凝胶过滤等,.,104,1离心,离心（centrifugation）分离是利用机械的快速旋转所产生的离心力，将不同密度的物质分离开来的方法。,.,105,超速离心,超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。,.,106,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,.,107,透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,超滤法利用超滤膜在一定压力下截取一定蛋白质的方法。,2透析与超滤,.,108,3凝胶过滤,凝胶过滤（gel-filtrationchromatography）是按照天然蛋白质相对分子质量大小进行分离的技术，又称为分子筛层析或排阻层析。,.,109,.,110,（三）根据蛋白质电荷性质的分离方法,常用的方法有：离子交换层析电泳等电聚焦,.,111,1离子交换层析,离子交换层析（ionexchangechromatography）是利用蛋白质两性解离特性和等电点作为分离依据的一种方法。,.,112,.,113,2.电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,.,114,几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳(2-DE)是蛋白质组学研究的重要技术。,.,115,SDS-PAGE分离蛋白质的机制,(A)SDS-PAGE凝胶电泳（B）聚丙烯酰胺凝胶的聚合,.,116,SDS-PAGE也可测定蛋白质分子量,.,117,等电聚焦电泳（isoelectricfocusingelectrophoresis,IFE）是在具有pH梯度的电场中进行的电泳，蛋白质按其等电点不同予以分离。,3.等电聚焦电泳,.,118,等电聚焦的原理,.,119,双向电泳（two-dimensionalelectrophoresis,2-DE）是利用不同蛋白质所带电荷和质量的差异，用两种方法、分两步进行的蛋白质电泳。第一步是以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，在玻璃管中进行IEF，使蛋白质按其不同的等电点进行分离。第二步是将IEF的胶条取出，横放在另一平板上，进行SDS-PAGE。第二次电泳的方向与IEF垂直，使已按IEF分离的蛋白质再进行一次按其不同质量再分离。,4.双向凝胶电泳(2-DE),.,120,双向电泳的原理及结果,.,121,三、蛋白质含量测定与纯度鉴定,（一）蛋白质含量测定1凯氏定氮法2Folin-酚试剂法3紫外线吸收法4考马斯亮蓝染色法,.,122,（二）蛋白质的纯度鉴定,蛋白质纯度常用某一特定成分与总蛋白之比来表示，如每毫克蛋白质含多少活性单位。,.,123,四、多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,.,124,Edman降解法测定氨基酸序列,.,125