引物设计步骤与要点

初级设计一步一步进行1.在NCBI搜索目标基因，找到该基因的mRNA。在CDS选项中，找到编码区域的位置。在下面的原点，复制编码序列作为软件查询序列的候选。2.使用引物引物5搜索引物(1)打开引物引物引物5，点击文件-新-DNA序列，打开输入序列窗口。复制目标序列在输入框中(选择“作为”)。在这个窗口中，序列也可以直接翻译成蛋白质。单击引物进入引物窗口。(2)该窗口可以链接到“初级搜索”、“初级编辑”和“搜索结果”选项。点击搜索按钮进入引物搜索框，选择“聚合酶链反应引物”和“配对”，设置搜索区域、引物长度和产品长度。在搜索参数中，可以设置相应的参数。一般情况下，如果没有特殊需要，参数可以默认选择，但产品长度可以适当改变，因为100200bp的产品电泳运行比较分散，所以可以选择300 500 BP。(3)点击确定，软件将自动搜索引物。搜索完成后，结果将自动跳出结果窗口。默认情况下，搜索结果将根据评级进行排序。点击任意一个搜索结果，引物的综合情况可以显示在“引物窗口”中，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。(4)对于引物序列，我们可以简单地进行检查，以避免以下情况：3不要连接3个连续的碱基，如GGG或CCC，否则很容易造成错配。在此窗口中，重要的是检查：Tm应在55和70度之间，气相色谱百分比应在45和55%之间，上游引物和下游引物的Tm值不应相差太大，最好低于2度。窗口底部列出了两个引物的二级结构信息，包括发夹、二聚体、引物间的交叉二聚体和错误起始位置。如果按钮显示为红色，则表示存在二级结构。单击红色按钮查看相应的二级结构位置图标。最理想的引物不应该有这些二级结构，也就是说，最好对这些按钮显示“无”。然而，有时很难找到满足所有条件的引物，因此可以适当放宽要求。例如，如果引物之间存在错配，可以根据具体情况考察错配的效率，以及产品是否会受到明显影响。引物的具体和详细评估需要通过寡核苷酸来完成。虽然寡核苷酸本身具有引物搜索功能，但它搜索的引物质量不如引物5。(5)在Primers 5窗口中，如果您认为一对引物是合适的，您可以在搜索结果窗口中单击引物，然后在菜单栏中选择文件-打印-当前对，并使用PDF虚拟打印机将其转换为包含引物详细信息的Pdf文档。3.用寡核苷酸验证评估引物(1)在寡核苷酸软件界面，在“文件”菜单下，选择“打开”以定位目标cDNA序列(在引物中，序列已保存为序列文件)，将弹出两个窗口，即“内部稳定性(G)”窗口和“Tm”窗口。在Tm窗口中，点击左下角的按钮，将出现引物定位对话框，您可以在其中输入候选物的上游引物序列位置(已经给出了引物5)，并且可以通过点击改变-当前寡核苷酸长度来改变引物长度。定位后，点击Tm窗口的上部按钮确定上游引物，用同样的方法定位下游引物，点击下部按钮确定下游引物。一旦确定了引物，就可以充分利用分析菜单中强大的引物分析功能。(2)在分析中，第一项是关键信息。点击选择的引物，给出两个引物的一般信息，包括引物的Tm值。该值ligo通过最近邻法计算，略高于引物5中的Tm值。该窗口还显示引物的G和3末端的G . 3末端的G太高，这将在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此该项的绝对值应该更小，优选不大于9。(3)分析中的第二项是双链形成，即二聚体形成分析。您可以选择上游引物或下游引物来分析上游引物和下游引物之间的二聚体形成，也可以选择上/下引物，即上游引物和下游引物之间的二聚体形成。引物二聚体是影响聚合酶链反应异常的重要因素。因此，在设计的引物中应避免二聚体，至少由设计的引物形成的二聚体应该是不稳定的，即其G值应该较低，一般不应超过4.5千卡/摩尔，结合碱基对不应超过3。在寡核苷酸的分析窗口中，分别给出了3端和整个引物的二聚体图和G值。(4)分析的第三项是发夹形成，即发夹结构分析。可以选择上游或下游引物。同样，G值不应超过4.5千卡/摩尔，碱基对不应超过3。分析中的第四项是成分和Tm，它将给出上游引物、下游引物和产品的各碱基的成分比和Tm值。上游和下游引物的气相色谱百分数应控制在40% 60%，上游和下游引物的气相色谱百分数不应相差太大。Tm值有三种，分别用三种方法计算，包括最近邻法、%primers 5应该使用最后一种方法。Tm值可以控制在50到70度之间。第五项是错误启动位点，即错误启动分析在素数5中也是可用的，但它没有寡核苷酸详细，寡核苷酸会给我正确的启动效率和错误启动效率。一般原则是使错误启动效率低于100。当然，有时错误启动效率在正确的地点是非常高的，例如，400 500。如果错误启动效率超过100，这是可以接受的。在分析中，最后一个有参考价值的项目是“聚合酶链反应”。在该窗口中，给出了基于该对引物的聚合酶链反应总结，并给出了该反应的最佳退火温度。此外，还提供了对这对引物的简要评价。如果引物具有不利于聚合酶链反应的二级结构，并且G值较大，寡核苷酸将在最终评估中显示。如果未指明此项，则表明二级结构的能量值较小，基本上可以接受。底漆评估完成后，您可以选择文件-打印，并将其打印为一个文件格式文件保存。该文件将包括多达几页的信息，这些信息包含在所有已在Oligo软件中打开的窗口中。因此，最好在打印前关闭Tm窗口和Delta G窗口，并保留引物信息窗口、二级结构分析窗口(如果有可疑异常)和聚合酶链反应窗口。4.确定引物后，分别对上游引物和下游引物进行Blast分析。一般来说，其他基因的一些同源序列或多或少会被发现。此时，只要没有其它基因杂交的同源序列，就可以比较和分析上游引物和下游引物的blast结果。二、底漆设计工艺经验1.初级读本5.0搜索初级读本(1)我经常将引物长度设置为18-30bp，短时特异性不好，长时不需要。当然，除非有特殊要求，比如添加酶切位点什么的。(2)聚合酶链反应产物的大小优选在100和500 bp之间。小于100-500bp的聚合酶链反应产物的琼脂糖凝胶电泳显示条带模糊且不好看。至于上限，没有必要严格。(3)搜索参数应为手动。搜索严格性应该高，气相色谱含量一般为40-60%。默认情况下，其他参数都正常。(4)将搜索到的引物按等级排序，并发送至ligo软件进行逐一评估。当然，搜索到的引物扩增产物很短，你不能选择它，或者引物的3-末端2 a或t，或者引物中有太多连续的g或c，或者引物的3-末端2 g或c，这样的引物应该作为二次选择选择，如果没有选择，应该选择它。对于这样的引物，如果其他指标可以接受，我想去掉一个不满意的，或者在引物末端增加一个碱基，看看引物的评价参数是否有所改善。2.Oligo 6.0评估引物(1)在分析中，无论是上游引物、下游引物还是在上游和下游引物之间，最稳定的3-二聚体的绝对值应小于4.5千卡/摩尔，而最稳定的二聚体的绝对值总体上应小于多少千卡/摩尔与聚合酶链反应退火温度有关。几个实验表明，当聚合酶链反应退火温度为65时，最稳定的总尺寸6.7千卡/摩尔没有问题。(2)发夹形成符合黄金法则(3)错误启动位点3360引物的启动效率应该是错配位点的4倍左右，越多越好。(4)在聚合酶链反应栏中，丁香园的同志们认为最佳退火温度的显示值值得参考。当探索聚合酶链反应的条件时，退火温度应该在正负2的范围内。内部稳定性非常重要：我们希望底漆的内部稳定性是一个高中低边的圆弧，至少要保证三个末端不太稳定。下图中的引物3太稳定，容易导致不适当的扩增。德尔塔集团指的是黄金法则，这其实是很好理解的：如果一滴水被放入大海，这滴水将不断扩散和分布。扩散越严重，结构越稳定，因此G的绝对值越大，结构越稳定。3.其他的(1)两种评价体系不同。丁香园的同志们觉得oligo对引物的评价更好。引物的引物通常根据效率进行分类，然后结合退火温度和引物长度，选择引物进行寡核苷酸检测。这是初步的选择。事实上，当引物是寡核苷酸时，退火温度也是不同的。(2)应避免3-末端二聚体。这取决于退火温度。50的退火温度肯定不同于65对二聚体的影响。一般来说，尽量控制在-4.5千卡/摩尔以下(从丁香园同志的角度来看，很多事情确实需要自己去探索)。(3)丁香园的同志们觉得有没有甲对3号