核酸等温扩增-杨银辉.ppt

核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用,军事医学科学院微生物流行病研究所杨银辉,核酸等温扩增技术,核酸等温扩增的优势,核酸等温扩增的种类,环介导核酸等温扩增技术（LAMP）,LAMP引物设计原则,LAMP扩增引物设计,LAMP扩增过程,环引物在茎环结构环状结构处识别并不断延伸，使双链过早打开，有利于复杂茎环结构的成环和外引物置换作用。这一定程度上加速了整个LAMP扩增循环阶段的反应。,LAMP的操作过程,检测方法,LAMP技术在病原体检测中的应用,LAMP技术小结,LAMP技术的优点,存在缺陷,所识别的靶位序列长度不得过大，一般在300bp以内。因此，无法进行长片段DNA的扩增；LAMP技术具备高灵敏度，对操作要求严格分区，否则极易受到污染而产生假阳性结果；LAMP的反应结果只有两种即扩增与不扩增，故在产生非特异性扩增时是难以进行后续鉴定的；产物相当复杂，无法进行后续的回收、鉴定、克隆等基因工程操作。,NASBA的优缺点,NASBA是种RNA扩增法，因此其主要应用是对RNA病毒的检测。整个反应能在42条件下进行，经过两个小时的扩增可将模板RNA放大至1091010倍。灵敏度高、特异性强、保真度高。反应成分复杂、需要三种酶导致成本偏高、须重复加入逆转录酶和T7RNA聚合酶。,滚环放大(rollingcircleamplification,RCA)技术,基于滚环只有在单链闭合状态并有相应引物存在下才能同温滚动复制的原理。基于连接酶连接、引物延伸与链置换扩增反应的一种等温核酸扩增方法。在恒温的条件下,可以产生大量的与环型探针互补的重复序列。RCA反应体系组成：噬菌体29DNA聚合酶、单链环状DNA模板和引物（一条或一对也可多条）。噬菌体29DNA聚合酶具备很强的链置换活性，无需模板分离，酶性稳定，可连续数小时高效催化合成DNA。,RCA的扩增原理,SAT技术,实时荧光核酸恒温扩增检测技术（SimultaneousAmplificationandTesting，简称SAT）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术。该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（1001000个）RNA拷贝；每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环；同时，带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况。,SAT技术的原理,SAT技术（SimultaneousAmplificationandTesting）是基于TMA（Transcriptionmediatedamplification）恒温扩增技术发展起来的一项最新核酸检测技术，是国内企业自主研发的专利技术,SAT技术的优势,针对靶标核酸特异设计的引物和分子信标，实现特异性的扩增和检测，有效防止假阴性结果。SAT检测的靶标核酸是RNA，而RNA在病原体外的环境中易降解，检测结果可作为区分死菌、活菌的依据，因此更利于用药之后疗效的监测和判愈。SAT技术的高灵敏度、高特异性则可以最大程度地确保检测结果的高度准确，高度可靠，有效避免假阳性、假阴性结果。,IMSA扩增,IMSA扩增的原理,IMSA扩增的原理,IMSA扩增的优点,IMSA不仅拥有LAMP检测技术类似的应用优点，在引物设计和扩增原理上还具有其独有的特点，使得其具备比LAMP更高检测灵敏度的潜力。该技术一定程度上能打破日本LAMP专利在我国的应用限制，使其更好地服务于我国的传染病防控、食品安全检测和环境物种保护等各个领域。,RPA技术,RPA（recombinasepolymeraseamplification）技术，2006年由剑桥大学的OlafPiepenburg等人建立。该技术利用一种重组酶使单链引物与双链DNA模板中互补片段结合，启动DNA复制；不需要DNA解链过程。其具有便携，免去PCR仪等大型实验室设备的使用；快速，20分钟内得到检测结果；灵敏度高，几个拷贝即可检出；便于保藏，采用冻干粉末状酶等优点。近年来，各国学者陆续利用RPA技术，对于DNA病毒、细菌等进行核酸检测。,RPA技术简介,RPA的原理,tetrahydrofuranabasicsitemimic(THF),四氢