分子诊断学绪论.ppt

临床分子诊断学,教材,分子诊断技术的理论（2-9）分子诊断技术的临床应用（10-13）,国情的咨文,美国总统奥巴马在2015年1月20日发表国情的咨文,？,2020年6月12日星期五,5,21世纪的经济将有赖于美国的科学技术和研究开发。我们曾消灭了小儿麻痹症，并初步解读了人类基因组。我希望，我们的国家能引领医学的新时代这一时代将在合适的时间给疾病以合适的治疗。对那些患有囊泡纤维化的病人，我们能将他们转危为安，这个病在过去是不可逆转的。今天晚上，我要启动一个新的“精准医学计划（PrecisionMedicineInitiative）”。这一计划将使我们向着治愈诸如癌症和糖尿病这些顽症的目标迈进一步，并使我们所有人，都能获得自己的个体化信息。我们需要这些信息,使我们自己,我们的家人更加健康。奥巴马（2015年1月20日）,要素精确准时共享个体化,7,精准医学的内容,一、启动“百万人基因组计划”。首先要征集100万的志愿者并做好队列（Cohort）及对照。建立与临床有关的“史无前例的大数据”，收集基因组数据与临床信息。二、寻找引发癌症的遗传因素，即继续美国的已经开始的癌症基因组研究计划三、建立评估基因检测的新方法，特别是对新一代测序技术的评估和审批通道，以及保护知识产权与有关版权的管理，以保证精准医学和相关创新的需求。四、制定一系列的相关标准和政策。从第一天开始，就要努力保护个人隐私和各种数据的安全五、PPP（Public-Private-Partnership，公私合作）。邀请企业家和非盈利组织参与。,8,以DNA和HGP精神为主线，以小儿麻痹症为先例旨在消灭单基因病，并以百万人的基因组临床信息的大数据来支撑癌症与其他多基因病的研究，改变政府支持和监管方式，强调企业参与的重要性，发动全社会支持的大型前瞻性项目。,绪论,introduction,滴骨验亲法,以生者的血滴在尸骨上，观察血能否浸入骨内，浸入的则被认为两者有血缘关系，在各种古籍中有多种记录。三国时代（公元220280年）谢承著会稽先贤传中的以弟血滴兄骨可能是记录此法的最早的史料：陈业的哥哥因海难不幸殒命，当时一同遇难的有五六十人，并且尸体都已严重腐败而无法辨认死者的身份。陈业就用刀刺破自己的手臂将血分别滴在尸骨上，发现其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陈业就这样确认其兄的尸骨。,整体水平,细胞水平,分子水平,16,以分子生物学理论为基础，采用分子生物学的方法和技术检测人体内的生物大分子的变化，从而为疾病的早期预警、诊断和预后提供辅助手段的应用科学。,临床分子诊断学,分子生物学,是分子水平的生物学，是在分子水平研究生命现象的科学，它研究的是生物大分子如核酸与蛋白质的结构、功能和生物大分子之间的相互作用。,以分子生物学理论为基础，采用分子生物学的方法和技术检测人体内的生物大分子的变化，从而为疾病的早期预警、诊断和预后提供辅助手段的应用科学。,临床分子诊断学,临床分子诊断学的研究对象,是在临床上影响健康或疾病状态的生物大分子，寻找其致病的分子机制，从而建立临床诊断、治疗检测和预后评估的辅助分子诊断方法。,分子生物学发展简史,两点重大突破：确定了蛋白质是生命的主要基础物质；确定了生物遗传的物质基础是DNA。,1、孕育阶段,19世纪中叶，蛋白质的发现EduardBuchner把酵母菌细胞的生命活力和酶的化学作用紧密结合，大大推动了微生物学、生物化学、发酵生理学和酶化学的发展19世纪中叶到20世纪初，组成蛋白质的20种基本氨基酸被相继发现（1935年，苏氨酸）著名生物化学家Fisher还论证了连接相邻氨基酸的“肽键”的形成。,1865年，孟德尔发表了植物杂交实验，首次阐述了生物界有规律的遗传现象。“遗传因子”1900年，孟德尔遗传规律被证实，成为近代遗传学基础。,孟德尔(GregorMendel)(1822-1884):奥地利科学家，经典遗传学的奠基人,1909年，约翰逊根据希腊文“给予生命”之意，创造了基因（gene）一词。,约翰逊（WilhelmLudwigJohannsen，18571927）丹麦生物学家,摩尔根(T.H.Morgan,1866-1945):美国的实验胚胎学家，遗传学家,1910年，Morgan的染色体基因遗传理论第一次将基因定位于染色体上。进一步将“性状”与“基因”相耦联，成为现代遗传学的奠基石。,1、Avery的肺炎双球菌转化实验DNA是遗传信息的载体；2、Hershey和Chase的噬菌体侵染细菌实验DNA是可以进入寄主细胞的转染因子。,证明DNA是遗传物质的两个著名实验：,1944年，Avery的肺炎双球菌转化实验，证明基因就是DNA分子，提出DNA是遗传信息的载体。,艾弗里（OswaldTheodoreAvery，18771955）,肺炎双球菌转化实验,1、将R型活菌注入小鼠体内,一段时间后,2、将S型活菌注入小鼠体内,一段时间后,3、将杀死的S型菌注入小鼠体内,一段时间后,4、将R型活菌与杀死的S型菌注入小鼠体内,一段时间后,细菌发生转化，性状的转化可以遗传。,格里菲思实验结论,已经被加热杀死的S型细菌中，必然含有某种促成这一转化的活性物质,转化因子,分别加入到培养R型细菌的培养基中,只得到R型,既有R型,也有S型,DNA,蛋白质,RNA,多糖,只得到R型,只得到R型,只得到R型,1952年，Hershey和Chase的噬菌体侵染细菌实验DNA是可以进入寄主细胞的转染因子,赫尔希（AlfredDayHershey，19081997）美国微生物学家,噬菌体侵染细菌的实验,用放射性同位素35S标记外壳蛋白质,细菌内无放射性,用放射性同位素32P标记内部DNA,细菌内有放射性,1957年，HeinzFraenkel-Conrat和B.Singre的杂合病毒实验证实RNA也是重要的遗传物质,1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。主要进展包括：遗传信息传递中心法则的建立对蛋白质结构与功能的进一步认识,2、创立阶段,Wilkins和Franklin通过对DNA分子的X射线衍射研究证实了前两者提出的DNA的模型。,1953年，美国科学家Watson和英国科学家Crick提出DNADoubleHelixmodel,1962年Watson、Crick与Wilkins共享诺贝尔生理医学奖。,DNA,RNA,蛋白质,复制,复制,转录,翻译,反转录,中心法则,1958年Crick提出中心法则,1958年，Meselson和Stahl证明DNA半保留复制。,1961年，法国科学家Jacob（雅各布）和Monod（莫诺）提出操纵子(operon)学说.,1965年获得诺贝尔生理医学奖,1968年，Nirenberg、Holley和Khorana解读了遗传密码及其在蛋白质合成方面的技能.,1968年获得诺贝尔生理医学奖,70年代初以后，是初步认识生命并开始改造生命的深入发展阶段，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能改造生命的新时期开始。,3、发展阶段（1970年代以后）,1970年Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶HindII，1972年，H.W.Boyer等相继发现了coRI一类重要的限制性内切酶。,限制性核酸内切酶的发现,基因工程诞生的技术发明,1967年，世界上有五个实验室几乎同时发现DNA连接酶，特别是1970年H.G.Khorana等发现的T4DNA连接酶具有更高的连接活性。,DNA连接酶的发现,1972年，美国Stanford大学的P.Berg等首次成功地实现了DNA的体外重组；,SV40,噬菌体,第一个重组分子,载体的发现,20世纪50到60年代，相继发现几种类型的质粒，如抗药性基因（R因子）和大肠杆菌因子（CoE）。这些工作为基因工程载体系统的建立打下基础。,1973年，Stanford大学的Cohen等成功地利用体外重组实现了细菌间性状的转移。1973年被定为基因工程诞生的元年。,基因工程诞生,Cohen等的重组实验示意图,Tcr,Ner,基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化,pSC101质粒DNA,R65质粒DNA,1977年，Sanger等人发明了一种测定DNA分子内核苷酸序列的方法（双脱氧链终止法）。,1980年，与Gilbert和Berg共享诺贝尔化学奖,聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR),62,人类基因组计划TheHumanGenomeProject,临床分子诊断学发展简史,1978年，著名的美籍华人简悦威（YuetWaiKan)等首先应用液相DNA分子杂交检测镰形细胞贫血症。标志着分子诊断学的诞生。,1、初级阶段,正常红细胞,镰刀型红细胞,ValHisLeuThrProGluGluLys正常ValHisLeuThrProValGluLys异常,血红蛋白分子的部分氨基酸顺序,正常,异常,6,6,谷氨酸,缬氨酸,正常,异常,_原因,_原因,根本,直接,GAG,GTG,聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR),2、1985年PCR技术的创建之后,2001年2月，随着首张人类基因组序列图谱以及随后其他物种基因组序列的公布，分子生物学进入了基因组与后基因组时代。基因组学、蛋白质组学等方面的巨大技术进步促进分子诊断学进入第三阶段，即以生物芯片技术为代表的高通量密集型技术。,3、以生物芯片技术为代表的高通量密集型技术,生物芯片技术始于20世纪90年代初其概念源于计算机芯片,VS,生物芯片技术的应用领域,药物合成,太空探索,感染性疾病的诊断,HBV病毒,HIV病毒,73,分子诊断在医学中的应用,感染性疾病的分子诊断病原微生物感染导致的疾病，仍然是严重威胁人类健康的一个重要方面。传统的病原体检测（微生物学检测、免疫学检测和血液学检测），不易早期诊断，并受到灵敏度限制。例如：肝炎系列、HIV，以及近年来一些严重的传染病疫情方面，分子诊断都发挥了重要的作用。,感染性疾病的分子诊断主要是针对侵入人体内的病原体基因进行检测。不同的病原体有各自的种属特异的基因。前人铺路，后人受益,一般性检出策略：通过探针或扩增技术直接检出病原微生物的DNA/RNA，判断有无感染或何种感染完整检出策略：不仅对病原体做出判断，还要进行分型（包括亚型）和耐药性方面的检测。思路：诊断分型亚型耐药性检测,感染性疾病分子诊断,肿瘤的分子诊断内容,诊断,预后评估,判定治疗效果,分子,内容,基因突变,基因表达,有无,类型,位置,效应,有无,水平,效应,临床应用,检测技术,PCR,基因测序,蛋白芯片,核酸杂交,免疫化学,肿瘤的分子诊断内容,样本,内容,与遗传有关的基因突变,检测技术,PCR,基因测序,蛋白芯片,基因测序,免疫化学,血液,肿瘤组织,血浆DNA变化,血浆变中癌基因表达检测,肿瘤标志物的检测,肿瘤细胞的基因突变,肿瘤细胞的基因表达,肿瘤细胞的蛋白表达,PCR,78,SmokingSwitched-ongenes,PatternAManyyearslater,PatternBManyyearslater,遗传性疾病的诊断,白化病,82,83,分子诊断在医学中的应用,遗传性疾病的分子诊断目前发现的人类遗传性疾病有数千种，分为两大类：符合孟德尔遗传规律的单基因遗传病和不符合孟德尔遗传规律的多基因遗传病（多因素遗传病）。传统的遗传疾病的诊断方法是以疾病的表形病变为依据，而表形易受外界