生化技术BiochemicalTechnique上海医科大学检验系临床....ppt

医学资料,1,BiochemicalTechnique,医学资料,2,一.什么是生化技术？生化技术是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。,医学资料,3,内容：生物大分子的一般制备分子生物学的基本操作,医学资料,4,分离纯化检测生物大分子电泳Electrophoresis层析Chromatography离心Centrifugation检测光谱分析法,分离,医学资料,5,二.生物大分子的一般制备法体液：直接分离生物样品组织细胞：先破细胞分离检测,医学资料,6,生物大分子制备的四个阶段,选择材料和预处理组织细胞的破碎及细胞器的分离生物大分子的分离纯化浓缩、干燥和保存,医学资料,7,（一）材料选择和预处理：微生物植物动物,医学资料,8,（二）组织细胞破碎的方法：1.物理方法：玻璃匀浆器(homogenizer),医学资料,9,研钵（加净砂或玻璃粉）,医学资料,10,高速组织捣碎器,医学资料,11,超声波,医学资料,12,渗透压法反复冻融法,医学资料,13,2.化学方法有机溶剂（破坏细胞膜的脂质双分子层）3.酶法自溶法（蛋白酶、酯酶）酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的-1，4-糖苷键）,医学资料,14,（三）生物大分子的分离、纯化以蛋白质为例【提取】相似相溶1.水溶液的提取中性盐溶液提取：缓冲液提取：2.有机溶剂提取,医学资料,15,【分离纯化】1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法：（1）盐溶与盐析（Saltingin&Saltingout)蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。,医学资料,16,当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。,医学资料,17,盐析作用的产生由于盐离子同水分子发生水合作用，造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子，减弱了蛋白质的水合程度。蛋白质表面的电荷被盐溶液中对应的离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋白质等的溶解度下降，蛋白分子相互聚集而沉淀析出。,医学资料,18,中性盐的选择硫酸铵(NH4)2SO4硫酸钠Na2SO4,医学资料,19,例：分离球蛋白和白蛋白血清1ml1mlPBS充分混合。逐渐加入饱和(NH4)2SO4溶液至50%，边加边搅拌。离心上清沉淀（球蛋白）,医学资料,20,（2）等电点沉淀法（溶解度最小）PIMWAlb4.866600015.0213000025.022000005.1213000006.87.31500000,医学资料,21,（3）低温有机溶剂沉淀法甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低并析出。脱水、介电常数小分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。（4）聚乙二醇沉淀法,医学资料,22,2.根据蛋白质分子大小不同的分离方法：,医学资料,23,（1）透析和超滤（Dialysis&Ultrafiltration)透析：利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。超滤（反向渗透）利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。,医学资料,24,（2）凝胶层析法（GelChromatography)利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。（3）SDS-PAGE,医学资料,25,3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法：醋酸纤维素薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳离子交换层析法,医学资料,26,醋酸纤维素薄膜电泳血清蛋白质的分离分子量pI白蛋白660004.861球蛋白1300005.022球蛋白2000005.02球蛋白13000005.12球蛋白15000006.8-7.3,医学资料,27,+,白蛋白,1,2,加样,医学资料,28,+,医学资料,29,清蛋白Alb,2,1,+,医学资料,30,医学资料,31,琼脂糖凝胶电泳,从海藻中提取出来的一种线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。,医学资料,32,分离血浆脂蛋白脂质蛋白质直径CM98%2%100VLDL90%10%75LDL70%30%20HDL50%50%10,医学资料,33,加样槽前,CMLDLVLDLHDL,+,医学资料,34,+,医学资料,35,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（1）丙烯酰胺结构式,医学资料,36,（2）亚甲双丙烯酰胺,医学资料,37,医学资料,38,等电聚焦电泳,载体两性电解质,医学资料,39,医学资料,40,离子交换层析法,医学资料,41,医学资料,42,4.根据配体特异性的分离法：亲和层析,医学资料,43,5.根据被分离分子的密度-离心技术,医学资料,44,【鉴定】检测-光谱分析法RNA&DNA260nm蛋白质280nm,医学资料,45,（四）浓缩、干燥、保存样品的浓缩1、减压加温蒸发浓缩2、空气流动蒸发浓缩3、冰冻法4、吸收法5、超滤,医学资料,46,干燥真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。冷冻干燥在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。,医学资料,47,保存1、干燥制品的贮存2、液态贮存样品不能太稀一般需加入防腐剂、稳定剂低温贮存,医学资料,48,三、分子生物学技术,重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离,DNA的提取：组织、细胞、质粒RNA的提取：组织、细胞PCR技术：常规PCR、RT-PCR限制性内切酶Westernblot,医学资料,49,四.生化技术的特点：1.条件温和2.实验条件与机体内环境尽量符合,医学资料,50,五.生化技术的应用：1.工业、农业研究、生产2.生化研究3.临床应用、诊断,医学资料,51,六.发展趋势：超微量高效自动化快速综合联用比色-计算机,医学资料,52,小结：1、掌握生物大分子的制备分离