植物组织培养.ppt

第十章植物遗传转化技术,一、植物遗传转化概况植物遗传转化（genetictransformation）是指利用重组DNA技术，细胞培养技术或种质系统转移技术，将外源基因导入植物细胞或组织，获得转基因植物的技术。,植物遗传转化技术是在1974年发现农杆菌Ti质粒的基础上形成的基因转移技术，1983年获得第一例转基因植物。1985年Horsch首创了叶盘法（leafdisctransformation），1987年，康乃尔大学研究者设计出基因枪；1987年，Jefferson等人提出GUS（葡糖苷酸酶）基因融合系统，作为报告基因。,目前已发展出多种遗传转化方法，包括物理方法、化学方法以及生物学方法。其中以农杆菌介导的遗传转化应用最广泛，占约80。转化的目的基因包括各种抗病、抗虫、抗除草剂、延迟保鲜、改变花色花型、改良品质以及疫苗等基因。,二、植物遗传转化技术转化方法可以划分为直接基因转移和间接基因转移。（一）直接基因转移：采用物理或化学的方法将外源目的基因转移到植物细胞，并整合到染色体DNA上的技术。包括电激法、基因枪法、超声波法、真空渗入法、PEG法、磷酸共沉淀法、微注射法、脂质体介导法等。,1、电激法：利用高压电脉冲把外源基因导入植物细胞实现转化的方法。1985年由斯坦福大学FrommM等最先将CAT基因通过电激法导入胡萝卜、烟草、玉米的原生质体，测得瞬间表达。随后康乃尔大学将外源基因导入原生质体实现长期表达。转化率随质粒DNA浓度、电脉冲强度以及持续时间增加而增加。,2、基因枪法（particlebombardment）：是利用高速微弹粒将外源遗传物质导入细胞或组织中的方法，也称为微弹射击法、粒子轰击法等。最早由KleinTM在1987年创立，并将烟草花叶病毒RNA和CAT基因(Chloraphericolacetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)导入洋葱表皮细胞。系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。,基因枪由激发器、枪管、挡板和无菌小室等组成。微弹直径14mm，将一定量的带有目的基因的质粒DNA，CaCl2、亚精胺与钨粒一起离心或振荡，可将目的基因吸附于钨粒，通过基因枪把钨粒以430米/秒的速度轰击目标，使目的基因穿过细胞壁和细胞膜进入受体细胞。,3、超声波法：根据超声波的空化作用，把外源基因导入受体细胞。1990年许宁等把GUS基因通过该方法导入了小麦幼穗愈伤组织。,4、PEG法：PEG具有细胞粘合作用和扰乱细胞膜的磷脂双分子层的作用。1980年由Darey最早利用该方法将外源基因转入原生质体。1985年以后利用该方法将报告基因转入种植物原生质体，获得瞬间表达或稳定表达。,5、脂质体转化法：利用磷酸碱或磷酸丝氨酸等脂质构成的双层膜囊，可以包裹质粒，DNA大分子、病毒颗粒等，通过脂质体与原生质体融合将外源基因转入原生质体细胞，或通过注射法实现转化。6、真空渗入法：利用真空作用使外源基因进入植物体，细胞并实现DNA的整合。,7、显微注射法：利用显微装置将质粒DNA注射入宿主细胞的方法。,（二）间接基因转移：以农杆菌或病毒为载体的基因转移过程称为间接基因转移。,1、农杆菌介导的基因转移：（1）Ti质粒：革兰氏阴性农杆菌（AgrobacteriumTumefaciens）中存在的一种质粒DNA。具有一段TDNA能够将外源基因转入植物染色体DNA中并实现整合。,Ti质粒约200Kb，一半序列参与质粒复制、冠瘿碱代谢和接合作用；对致瘤不起作用，另一半序列包括TDNA区和毒性区（Virregion）。TDNA：章鱼碱型农杆菌Ti质粒TDNA由两部分组成，一部分与致瘤有关，称为左转移DNA（TLDNA），另一部分与致瘤无关，称为右转移DNA（TRDNA）。TLDNA含有编码合成激素类和冠瘿碱类的基因，由于激素基因在植物细胞内的表达，产生了过量的生长素和细胞分裂素，破坏了内源激素平衡，而导致植物细胞发生癌变。,Vir区：是TDNA以外涉及诱发肿瘤的区域，在Ti质粒的物理图上位于TDNA左侧，长3040Kb，Vir区并不整合入植物基因，但却是TDNA转移所必需。TDNA边界序列：TDNA长约23Kb，但在其两端边界各有一个25bp的正向重复序列，高度保守，一般认为右端重复序列对TDNA转移起重要作用。,农杆菌转化植物细胞的机理：（1）农杆菌对植物伤口的附着；植物伤口释放出信号分子。如乙酰丁香酮（AS）以及羟基乙酰丁香酮（OHAS）等。,（2）Vir区基因表达的诱导；VirA以及VirG基因在酚类物质的诱导下得到表达。（3）TDNA中间体和T链蛋白复合体的形成；VirD1和VirD2蛋白表达与TDNA边界重复序列结合解缠绕与切割，VirC1和VirC2参与下，形成TDNA转移中间体。并以DNA蛋白质复合体形式存在和转移。VirE1和VirE2参与该过程。,（4）T链蛋白复合体转移至植物细胞；T链蛋白复合体（T链、VirD2、VirE2）在VirB基因表达产物作用下，穿越细胞膜，VirB操纵子具有11个基因，产物定位于细胞膜上并形成一种膜结合T复合体运输器，其中VirD2和VirE2蛋白分别具有导航和核定位作用。VirD2、VirE2以及VirF蛋白进入植物细胞。（5）TDNA拷贝与植物基因组的整合。T链蛋白复合体转移到细胞后，通过核膜上的小孔进入细胞核，与核DNA整合。整合机制尚不清楚。,Agrobacteriaattachtoplantcellsurfacesatwoundsites.Theplantreleaseswoundsignalcompounds,suchasacetosyringone.ThesignalbindstovirAontheAgrobacteriummembrane.VirAwithsignalboundactivatesvirG.ActivatedvirGturnsonothervirgenes,includingvirDandE.virDcutsataspecificsiteintheTiplasmid(tumor-inducing),theleftborder.Theleftborderandasimilarsequence,therightborder,delineatetheT-DNA,theDNAthatwillbetransferredfromthebacteriumtotheplantcellSinglestrandedT-DNAisboundbyvirEproductastheDNAunwindsfromthevirDcutsite.Bindingandunwindingstopattherightborder.TheT-DNAistransferredtotheplantcell,whereitintegratesinnuclearDNA.T-DNAcodesforproteinsthatproducehormonesandopines.Hormonesencouragegrowthofthetransformedplanttissue.Opinesfeedbacteriaacarbonandnitrogensource.,农杆菌Ti质粒载体系统：组成重组质粒，含有边界序列，能够在大肠杆菌和农杆菌中穿梭；含有完整的Vir基因。（1）共整合载体系统：Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322DNA所取代，带有外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，发生同源重组，外源基因整合到Ti质粒上。（2）二元载体系统：一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒，一个含有TDNA和外源重组基因的多功能克隆载体质粒。既能在农杆菌中复制，并能够从大肠杆菌迁移到农杆菌，另一个质粒含有Vir基因的Ti衍生质粒。,（2）Ri质粒：一种能够诱导植物细胞产生毛发状根的土壤杆菌（Agrobacteriumrhizogenes），具有Ri质粒，能够将外源基因转入植物细胞中。其TDNA包括TLDNA和TRDNA和中间大约15Kb的核心DNA，在TRDNA上具有两个非常重要的基因，tms1和tms2，指导IAA合成，TRDNA上还有编码农杆碱合成和甘露碱合成的基因