大肠杆菌与遗传测序PPT课件

主要通过检测什么检测大肠杆菌：1、菌落数量2、大肠杆菌生成物间接检测(-半乳糖苷酶,-葡萄糖醛酸酶)3、表面抗原4、DNA,主要通过检测什么检测大肠杆菌,1、芯片化的大肠杆菌检测法,1.1、在线富集技术在微流控芯片上实现低浓度细菌微生物超灵敏检测,背景：由于在水、食品和临床样品病菌的感染剂量可能非常低,为了能够快速测量存在于实际样品中低浓度的病原微生物,科研工作中己经投入了相当大的精力到这一领域。本文通过将壳聚糖(CS)扫集,反转电场堆积和场放大样品堆积多步浓缩方法联合,在芯片上实现了细菌的高效检测。（了解）,由于CS（壳聚糖）带有大量正电荷因此常被用于絮凝吸附剂和不同作用的绑定试剂。因为在细菌和病毒细胞外膜表面具有羟基和磷酸根基团,常使其带负电荷,CS与细胞可通过静电作用可使其聚集。并且CS也常作为天然抗菌剂被大量使用。因此,CS的高吸附能力可使其用于细菌浓缩,并且作为扫集试剂可以保持细胞的活性。此外,通过将CS扫集、场放大样品堆积和反转电场富集技术联合使用,在微流控芯片上一体化实现了多步浓缩检测方法。（知道）,材料和仪器三羟基甲基氨基甲烧(Tris),硼酸,乙二胺四乙酸(EDTA)购买于Aldrich公司(Milwaukee,WI,USA)。壳聚糖,牛璜酸和半胱氨酸购买于上海国药集团。大肠杆菌、E.coli)购买于广东微生物种质资源库。所有的实验在自制的微流控-激光诱导焚光检测系统(MCE)上实施。微流控系统主要由上海光谱有限公司提供。(了解),细菌悬浮液的准备：大肠杆菌在LB培养基30度下培养13h。在3400rpm（每分钟转数）离心5min,上清液去除,再次用无菌水对细胞进行清洗,离心,重复这个过程5次以去除残留的培养基并且达到清洗细胞的目的。近红外核酸荧光染料SYTO62用来标记细菌细胞。最后,标记的细菌细胞悬浮在含有牛磺酸的缓冲溶液,浓度约1.0 x107CFU/mL。在每次使用之前,新准备的细胞悬浮液需要漩祸60-90S以避免细胞聚集。（了解）,微流控芯片系统的条件：用于实验的“十字”通道微流控芯片微通道深为25宽为100um。分离通道长为50mm,其他通道与交叉口的距离为10mm。铂电极作为电源与溶液之间的导电电极。芯片使用之前需要用98%的浓硫酸和去离子水各冲洗10min。随后,用1mol/LNaOH冲洗通道20min,再用去离子水冲洗10min,最后用运行缓冲溶液清洗10min。芯片清洗过后,将含有CS（壳聚糖）的分离缓冲芯片对通道进行预涂敷处理。（参考）,微流控芯片多步浓缩方法用于细菌检测：对于场放大细菌堆积,与运行缓冲溶液相比,细菌细胞应该分散在更低电导率的样品缓冲溶液中。牛磺酸能够使细胞聚集从而改善检测灵敏度,将少量的牛磺酸添加到悬浮液中。下图是芯片电泳五步浓缩过程示意图。通过施加相应的电压对细菌细胞进行在线富集和浓缩。（图）,细菌在线富集分离机理示意图。(A)预上样;(B)进样,(C)场放大样品堆集和扫集,(D)反转电场富集,(E)分离。黑色区带代表浓缩的细菌样品,灰色代表样品基质,空白代表含有CS（壳聚糖）的运行缓冲,箭头表示电渗流方向。AnalyticalChemistry,2012,84,1687，华东师范大学，王志芳,标准条件下多步浓缩富集方法对大肠杆菌的定量检测曲线。,自然水体中大肠杆菌的检测：由于地表水中细菌的浓度经常30CFU/mL,具有较高富集倍数的检测方法才能测定河水中的大肠杆菌。此外,因为河水中常含有CO32-、SO42-等，运行缓冲的电导率远远低于河水。由于使用的浓缩方法部分是基于运行缓冲和样品缓冲中不同的电导率,因此必须过滤水样以去除水中含有的离子。此外,经过预富集的细菌水样的浓度必须达到多步浓缩方法的检出限。因此可以通过无菌滤膜过滤预富集水样中的大肠杆菌。,多步浓缩富集方法对地表水中大肠杆菌的检测,小结：为了提高检测灵敏度,能够实现实际样品中低浓度细菌的测定,将堆积、扫集和其它预浓缩方法的联合使用是必要的。我们通过使用微流控芯片展示了多步浓缩方法(CS扫描、反转电场和场放大样品堆积)可以用来加强细菌富集,实现低浓度污染的样品的测定。对比于常用的细菌检测方法,多步方法具有高灵敏度、低样品需耗量和快速分析的优点。（知道）,1.2、纳升级液滴阵列实时定量RT-PCR系统的研究综述：基于平面液滴阵列的微流控系统具有系统简单、成本低廉、液滴操控灵活、适于多步集成操作及液滴后续操作等优点,在微流控系统的实时定量PCR技术显示了广阔的应用前景,尤其是基于液滴的PCR系统。液滴微反应器将反应液分隔在单分散体系中,减少了PCR歧视及非特异性扩增;反应体积可为纳升至皮升级,与细胞体积相当,能够有效限制内容物的扩散,降低背景对信号的稀释作用;通过不溶相使液滴微反应器与微通道内壁间隔开来,最大限度地减少了通道内壁对试样的吸附,消除了交叉污染。（知道）,背景：MicroRNA(miRNA)是一类非编码的小RNA序列,其长度只有18-25个碱基。越来越多的研究证明,miRNA在很多基因的表达过程中起到了分子开关的作用,在许多癌症及重大疾病的发生和发展中,miRNA都出现了异常表达现象。因此准确对miRNA进行定量检测具有重要的生物学和临床意义。（了解）,技术条件：实时定量(反转录)聚合酶链式反应(以下简称qPCR或qRT-PCR)技术是以传统PCR技术为基础建立起来的一种可对原始核酸(包括DNA和RNA)模板拷贝数进行准确定量分析的一种现代分子生物学检测技术,已经广泛地用于分子诊断,疾病研究,临床医学等领域。qPCR技术遵循传统PCR的扩增原理,不同的是在每一个循环的退火或延伸阶段进行实时荧光检测。根据溶液中模板的原始拷贝数的对数与扩增循环数Ct存在的线性关系,对核酸进行定量分析。实时定量PCR技术具有准确度高,灵敏度高及检测范围宽(超过5个数量级)等特点,因此非常适用于miRNA的定量检测。（知道）,实验材料及试剂：单晶桂片(N111型):上海齐鸣桂材料有限公司,上海。氧化锡铟(ITO)玻璃(1.1mm厚,lOohm/m2):深圳莱宝高科技股份有限公司,深圳。AZ4620光胶:安智电子材料公司,苏州。环氧树脂(合众全透明AAA超能胶):浙江黄岩光华胶點剂厂,黄岩。荧光素纳(产品编号:FT0989):上海生工生物工程股份有限公司,上海。氟化铵(NH4F):国药集团化学试别有限公司,上海。氢氧化纳(NaOH):国药集团化学试剂有限公司,上海。浓硫酸(H2SO4):国药集团化学试劍有限公司,上海。氢氟酸(HF):国药集团化学试刻有限公司,上海。硝酸(HN03):国药集团化学试劍有限公司,上海。异辛院:国药集团化学试剖有限公司,上海。无水乙醇(C2H5OH):国药集团化学试剂有限公司,上海。（了解）,实验溶液配制：硅烷化试剩:将OTCS与异辛烷混合作为硅烷化试剂,体积比为0.1%-1%均可,现用现配。芯片刻姓液分别量取HF16mL、NH4F7.4g.HNO319.2mL.去离子水364.8mL在塑料器皿中混勻,配置成摩尔浓度比HF:NH4F;HNO3为1:0.5:0.75的芯片刻烛液,常温保存,可重复使用。光刻显影液:称取0.7gNaOH固体溶解于100mL去离子水中,配置成0.7%NaOH溶液,作为光刻显影液。0.1M荧光素纳溶液:用于多步加样过程的观察。成熟miRNA-122(mir-122,UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUG)序列来源于SangerCentermiRBase,由上海吉玛制药技术有限公司(上海)负责合成。2%RNase清除剖(体积比):使用娃哈哈纯净水稀释RNase清除刻,用于芯片及PCR耗材清洁。（了解）,实验芯片：亲水点阵列芯片加工，采用CorelDRAWX3软件绘制芯片掩膜图。硅片为直径76mm的圆形薄片,每块桂片可加工出7块13X13mm芯片。芯片设计成6X6点阵,点直径为0.5mm,间距为1.7mm。（参考）,实时定量RT-PCR系统构建：将芯片置于商品化基因扩增仪(MGL96G/Y,杭州朗基科学仪器有限公司)的载物合上,用PCR仪控制热循环温度。将ITO玻璃罩在芯片上方,结合自制的温度控制模块,维持温度恒定,以起到热盖的作用。以汞灯作为荧光激发光源,利用Nikon体视荧光显微镜(SMZ1500,Nikon,Japan)的光路系统采集荧光。用Labview(Labview8.0,NationalInstruments,Austin,USA)程序控制CCD(电荷耦合器件)和自制的挡光阀,在每个循环退火阶段拍摄荧光照片。（图）,实时定量RT-PCR系统示意图，浙江大学，张云霞，2013.04,数据采集处理：采用自编的Labview程序读取各个循环荧光照片上液滴的荧光强度值,得到荧光强度随反应循环数增加的变化曲线。以各条曲线前10个循环荧光强度值Rn的标准偏差的10倍作为阈值,取大于阈值的循环数作为CT(临界循环次数)值。以加入miRNA-122的拷贝数的对数值作为横坐标,CT值为纵坐标拟合出标准曲线。（了解）,Labview数据采集系统软件界面,芯片清洗及注意：每次使用后,使用医用脱脂棉蘸洗海刻搓洗芯片表面,再分别用去离子水及娃哈哈纯净水冲洗。清洗表面后,将芯片置于2%RNase清除剂中浸泡5min,以减少RNA降解,避免PCR污染。用娃哈哈纯净水冲洗后,在烘箱中65C-80C烘干30min。清洁后的芯片置于干净的培养皿中,室温存放。实验中经清洗后的芯片不会产生PCR污染,可反复使用。芯片最长使用时间可达一年。本实验全程需佩戴口罩及乳胶手套。芯片硅烷化、光刻及湿法刻烛过程中,使用试刻的挥发性和腐蚀性较强,尽量在通风橱内操作。玻璃研磨过程中要带防护眼镜以保护眼睛。（知道）,小结：本工作中,我们发展了一种半敞开式的纳升级平面液滴阵列平台,并将其应用于miRNA-122的实时定量RT-PCR检测中。利用平面液滴的优势,在经表面修饰的亲水点阵列芯片上,实现了液滴的定位和多步加样操作。该芯片具有加工简单、操作灵活、易于普及等优点,可以作为一种通用型的生物化学反应平台使用。此外,该系统可在试剂消耗、检测通量及系统集成化微型化等方面进一步优化改进,有望在大规模高通量分析领域发挥重要的作用。（知道）,1.3、基于纳升级液滴阵列的自动化单细胞实时定量RT-PCR系统的研究,综述：研究基因型与表现型之间的关系是生物学及医学发展的重要环节,以定量测定细胞内各类RNA表达为目标的转录组研究对于基因表达和分子诊断研究尤为重要。同一器官中的所有细胞具有特定的基因型,而细胞个体之间基因表达却有很大差异,这就造成了细胞亚群的分化,并具有不同的生理功能、应激行为及表现型。由于这种细胞异质性的存在,转录组研究需要在单细胞水平进行。因而，针对单细胞的基因分析为大量细胞中稀少变异细胞的检测提供了方法,特别对重大疾病与癌症的早期诊断、胚胎植入前遗传学诊断、微生物亚群分类及法医鉴定等研究具有非常重要的作用。（了解）,实验材料及试剂：溶融石英毛细管:河北永年锐洋色谱器件有限公司Tygon（聚乙烯）管:Saint-GobainPerformancePlastics,Franceo微量注射器(10pL,1701N):Hamilton,Switzerland。DMEM（细胞培养基）高糖培养液:Gibco,LifeTechnologies,USA。FBS（胎牛血清）:Gibco,LifeTechnologies,USA。PBS（磷酸盐缓冲液）(PH7.2):Gibco,LifeTechnologies,USA。生理盐水(0.9%NaCl溶液):浙江大学校医院,杭州。Calcein-AM(活细胞荧光染色别)Invitrogen,LifeTechnologies,USA。（了解）,实验芯片：采用AutoCAD2008软件绘制芯片掩膜图。硅片为直径76mm的圆形,每块桂片可加工出7块面积为13mmx13mm的方形芯片。芯片设计成16x16点阵,点直径为0.2mm,间距为0.7mm。（参考）,高密度亲水点阵列芯片AutoCAD掩膜图,毛细管探针加工：为了提高液滴量取精确度,减少样品携出和交叉污染,实验中所用毛细管均采用手工拉制方法加工成圆锥形毛细管取样探针。（了解）自动化液滴生成及操控系统的构建：液滴生成及操控系统主要由液滴定量量取、液滴储存及样品储存平台等结构构成,并采用Labview程序控制整个系统自动运行。采用高密度亲水点阵列芯片作为液滴承载与储存平台。采用x-y-z三维电动平移台(PSA200-11系列,北京卓立汉光仪器有限公司)精确控制操作位置,分辨率为10um。（图）,自动化液滴生成及操控系统示意图,自动化液滴生成及操控系统实物照片，浙江大学，分析化学实验室,实时定量RT-PCR检测系统的构建：采用两只蓝色发光二极管(LED,3W,Gree,深圳立诺科技有限公司)作为荧光激发光源。并在LED前端安装窄带滤光片(470nm,沈阳汇博光学技术有限公司),以降低背景干扰。采用加装有成像透镜(MLM-3XMP,Computar,Tokyo,Japan)及窄带滤光片(535AF40,Omega,Brattleboro,USA)的CCD（电荷耦合器件）照像机(DH-SV1401FC/FM,北京大恒图像有限公司)作为图像传感器,在每个PCR循环的退火阶段自动拍摄荧光照片。与之前基于体式荧光显微镜的检测系统相比,该系统具有体积小、耗能少、灵敏度高等优点。（图）,实时定量RT-PCR检测系统示意图,实时定量RT-PCR焚光检测系统实物照片,实时定量RT-PCR焚光检测系统的Labview控制程序界面,单细胞miRNA-122RT-PCR检测：以培养的细胞作为模型样品。在细胞进入指数生长期时进行细胞传代。将细胞消化后,重悬于1mL细胞培养液中。向培养液中加入0.5uLCalcein-AM细胞染色剂,在37C水浴中染色15min。细胞染色后,使用PBS(磷酸盐缓冲液)溶液清洗三次,并重悬于PBS溶液(含有BSA（牛血清蛋白）0.05mg/mL)中。采用血球计数板(上海求精生化试刹仪器有限公司)进行细胞计数,并调整细胞悬液浓度。采用热裂解方式(95C5min)进行细胞破膜。之后进行PCR扩增，芯片上PCR反应的热循环设置为95C-30s,60C-70s。（了解）,数据釆集处理：釆用自编的Labview程序读取各个循环焚光照片上液滴的焚光强度值,得到荧光强度随反应循环数增加而改变的曲线。建立循环数CT与miRNA-122的拷贝数的对数值的标准曲线（了解）,1.4、微流控芯片上大肠杆菌的电化学阻抗检测方法研究,基于细菌悬浮液的阻抗特性和微流控芯片电化学阻抗检测技术，采用所构建的微流控芯片电化学阻抗分析系统，以大肠杆菌为样本，优化了扰动振幅、缓冲溶液电导率、扫描频率和新制大肠杆菌标本静置时间等参数，对大肠杆菌标本、大肠杆菌标准合成样本进行电化学阻抗检测，建立了一种大肠杆菌快速定量检测方法。（知道）,优化条件：扰动振幅500mV、缓冲溶液电导率为2.40uS/cm、扫描频率范围为100Hz-1MHz的条件下，大肠杆菌的测试范围为7.431051.49108CFU/mL，检出限为7.43104CFU/mL。显微测试表明，在该检出限下，微流控芯片电化学阻抗分析系统对微管道检测区域内10个以上大肠杆菌就有明显响应。将所建立的方法应用于某污水中细菌检测，结果与国标法基本一致。（了解）,仪器与试剂：VersaSTAT3电化学工作站(美国普林斯顿)、Sension5电导率仪(美国哈希公司)、OLYMPUSIX71显微镜(日本奥林巴斯公司)、SWCJO超净台(苏州净化公司)。LB培养基、营养琼脂(上海生工);甘露醇(AR，温州东升化工);KH2PO4(AR，重庆川东化工)等。缓冲溶液配制:0.1mol/L甘露醇溶液为基质，以磷酸盐缓冲液(PBS)调节至所需电导率，经0.22um微孔滤膜过滤得缓冲溶液。大肠杆菌标准合成样本:将大肠杆菌标本适当稀释得系列大肠杆菌标准合成样本，并采用平板计数法测定浓度。细菌样本:以大肠杆菌为主要菌群的某污水池为采样点，按国家标准方法采集水样。（了解）,试验方法：芯片上阵列式电极是通过MEMS技术在玻璃基片上沉积的电极，对电极间距k分别为130，110，90，70和50um，电极宽d1为100um，相邻电极间距d2为20um，L为1780um，D为1100um。阵列电极将有效检测面积增大至0.32mm2，增加响应灵敏度的同时提高信号均匀性和重现性。盖片采用SU-8阳膜制作的带有微管道网络的聚二甲基硅氧烷(PDMS)薄膜，微管道深度为30um，宽度为300um，长度为15000um，微管道体积1.3510-4mL。将玻璃基片和盖片对位粘合，即构成复合式玻璃-PDMS微流控阻抗检测芯片。（图）,微流控芯片电化学阻抗检测芯片，彭金兰，重庆大学化学化工学院，分析化学，2011.9.15,芯片上大肠杆菌电化学阻抗检测条件优化：在缓冲溶液电导率为2.47uS/cm，扫描频率1.01.0106Hz，新制大肠杆菌标本静置90min的条件下，测定不同扰动振幅(50900mV)下大肠杆菌标本(1.49107CFU/mL)的阻抗谱，确定扰动振幅。（了解）,扰动振幅优化：将大肠杆菌标本静置90min，测定不同扰动振幅(50900mV)下大肠杆菌标本的阻抗谱。随着扰动振幅的逐渐降低，阻抗波动越明显，尤其是低频段。研究显示只要不出现高次谐波，高阻抗系统的扰动幅值可以稍大。因此选择500mV作为扰动振幅。（了解）,不同扰动振幅下细菌标本阻抗检测lg|Z|-lgf关系图,芯片上大肠杆菌电化学阻抗检测定量分析：在优化条件下，对系列浓度(7.431051.49108CFU/mL)大肠杆菌标本进行电化学阻抗检测，以大肠杆菌浓度(C)为横坐标，以某频率下阻抗(|Z|)为纵坐标，建立细菌标本|Z|与C的关系曲线。由于高频段相关系数较低，通过综合实验分析，采用1.010210104Hz频率段的阻抗数据建立定量曲线。（了解）,细菌标本悬浮液阻抗检测|Z|-C定量曲线,以某污水为分析样本，进行采样、计数、预处理及检测。其检测方法是在芯片管道两端连接软支管道，使缓冲溶液(0.5uL)充满管道，液差驱动大肠杆菌悬浮液进入微管道，大肠杆菌悬浮液进样量约5uL，流速约1uL/min;电化学测试仪由引线1和2连接微流控芯片，对样本进行电化学阻抗检测;数据采集系统采集并保存数据。然后与标本悬浮液阻抗与浓度之间的定量曲线关系进行比照，定量分析。相比于现行国标方法，本方法只需经简单膜过滤即可进行检测，2min可以完成单样本检测，20min内即可完成污水中细菌检测分析。（了解）,1.5、集成酶微反应器微流控芯片葡萄糖电化学检测,概述：临床上所称的血糖通常是指血液中的葡萄糖。正常人的血糖浓度在神经系统的调节下保持相对恒定的水平。血糖浓度如果超过正常水平,表示体内糖的利用发生紊乱;血糖浓度如果过低,则中枢神经系统会发生严重的功能障碍,出现昏迷,即低血糖昏迷。本实验将葡萄糖氧化酶直接固定在微流控芯片通道的内壁上,使酶反应和电极反应过程都集中的微流控芯片通道中进行,实现反应器的集成化,并由于芯片表面较粗糙,可增加酶的担载量,提高了该生物传感器的灵敏度。（了解）,仪器：XMC5400程序升温控制仪(福建东辉智能仪器有限公司);SX2-4-10箱式电阻炉(沈阳市电炉厂);微量注射泵(BioanalyticalSystemsInc.);铬版玻璃(长沙韶光铬版有限公司);石英毛细管(河北永年锐沣色谱器件有限公司);电化学工作站(CHI760型,上海辰华仪器公司);银/氯化银参比电极(上海辰华仪器有限公司);以铂丝(D=50um)作为工作电极,市售Ag/AgCl电极作为参比电极,铂丝(D=50um)作为对电极。（了解）,试剂：葡萄糖氧化酶(GOD,Sigma);葡萄糖(分析纯,沈阳新兴试剂厂);壳聚糖(脱乙酰度90%,上海伯奥生物科技有限公司);戊二酸(分析纯,沈阳化学试剂厂);磷酸氢二钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);磷酸二氢钾(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);冰醋酸(分析纯,北京北化精细化学品有限公司);乙酸钠(分析纯,沈阳市试剂四厂);盐酸(优级纯,哈尔滨化工化学试剂厂);无水乙醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);硝酸(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);氯化钠(分析纯,天津市博迪化工有限公司);氢氧化钠(分析纯,天津市博迪化工有限公司);浓硫酸(9598%,辽宁省兴城市红星化工厂);铁氰化钾(分析纯,沈阳试剂一厂);氯化钾(分析纯,国药集团试剂有限公司);实验用水均为二次蒸馆水。（了解）,原理：基于葡萄糖经过固定有葡萄糖氧化酶的酶反应器时产生过氧化氢,过氧化氢在一定的正的工作电位下在工作电极表面被氧化,释放出电子,产生氧化电流。且释放出电子的量与酶反应产生的过氧化氢的浓度成正比,因而可以通过测定产生的氧化电流值来测定过氧化氧的量,间接测定葡萄糖的含量。（知道）,固定化酶电化学法测定葡萄糖原理，东北大学，张玉梅，硕士论文，2009.7,微流控芯片示意图,实验操作方法的建立：在微流控芯片的通道中平行插入两根铂丝(D=50um),铂丝与导线焊接后,作为电极,制成微流控芯片检测池,在微流控芯片的通道内壁通过共价键合法固定葡萄糖氧化酶,制成酶微反应器。此时,微流控芯片既是酶反应器,又是电化学检测池,葡萄糖检测过程中的所有反应均在微流控芯片的微通道中进行,实现反应仪器的集成化。（了解）,工作电极循环伏安扫描曲线a:固定未GOD的曲线,b:固定GOD的曲线,缓冲溶液pH值对响应电流的影响,不同浓度的葡萄糖的响应电流,葡萄糖浓度与葡萄糖生物传感器响应电流的关系工作电位:+0.5V.缓冲溶液pH值:7.4,流速:3.0uL/min,2、基因测序,2.1.1、第一代测序方法：化学降解法原理：将一个DNA片段的5端磷酸基作放射性标记，再分别采用不同的化学方法修饰和裂解特定碱基，从而产生一系列长度不一而5端被标记的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过凝胶电泳分离，再经放射线自显影，确定各片段末端碱基，从而得出目的DNA的碱基序列。（知道）,生物学上bp代表碱基对；1bp=1碱基对。,主要试剂硫酸二甲酯（dimethylsulphate，DMS）是一种碱性化学试剂，可以使DNA链上的A（腺嘌呤）的N3和G（鸟嘌呤）的N甲基化，但是G的N甲基化速度比A的N3甲基化速度要快4-10倍，并且在中性pH环境中，DMS主要作用于G，使之甲基化，导致糖苷键断裂。肼，又称联氨，在碱性环境中作用于C（胞嘧啶）和T（胸腺嘧啶）的C4和C6位置，导致糖苷键断裂。如果加入高浓度的盐（1.2MNaOH），肼则主要作用于C，使之断裂。（了解）,基本步骤(1)先将DNA的末端之一进行标记，通常为放射性同位素32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列（知道）,2.1.2、第一代测序方法：双脱氧链终止法（Sanger法）原理：由于ddNTP（双脱氧核苷三磷酸）与dNTP（对硫磷）相比缺乏3-OH，参与DNA链不能形成下一个磷酸二脂键，因此，被用来中断DNA合成。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例的带有放射性同位素标记的某种ddNTP，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和X-射线放射自显影后，可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。（知道）,Roche生化资讯2008年1月,2.1.3、第一代测序方法：荧光自动测序技术原理：基于Sanger双脱氧链终止法的原理，只是用四种不同的荧光染料分别标记ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基延伸的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。（知道）,2.2.1、第二代测序方法：GSFLX测序技术（454法）原理：一种依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP（对硫磷）的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，实现测定DNA序列的目的。（知道）（图）,荧光素酶,ATP硫酸化酶,焦磷酸,荧光素,氧化荧光素,可见光,GeneFocus2010.5,主要步骤：文库制备文库连接到测序珠上悬滴PCR扩增，富集测序珠上机测序,测序模拟图,GSFLX测序特点：不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳，分析结果快速、准确、灵敏度高且实现了自动化。突出优势：较长的读长，其读长已超过400bp。误差来源：454FLX测序的准确率在99%以上，其主要限制来自同聚物，也就是相同碱基的连续掺入，如AAA或GGG。由于没有终止元件来阻止单个循环的连续掺入，同聚物的长度就需要从信号的强度中推断出来。这个过程可能产生误差。因此，454FLX测序的主要错误类型是插入/缺失，而不是替换。（知道）,第二代测序技术：Solexa测序技术原理：将待测DNA打断成约100200bp大小，在片段两端接上接头。将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上，另外一端随机和附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成桥状结构。通过扩增，形成单克隆的DNA簇，随后将DNA簇线性化。在下一步合成反应中，加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP（对硫磷）。在DNA合成时，每一个核苷酸加到引物末端时都会释放焦磷酸盐，激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫描反应板表面，在读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类后，将这些荧光集团化学切割，恢复3端黏性，随后添加第二个核苷酸。如此重复，直到每条模板序列都完全被聚合为双链。这样统计每轮收集到的荧光信号结果，就可以得知每个模板DNA片段的序列。(知道),测序步骤：1、测序文库的构建2、锚定桥接3、预扩增4、单碱基延伸测序5、数据分析,添加接头：利用物理方法将待测样品DNA打碎，在单链DNA碎片两端加上接头。,表面结合：Solexa的测序时利用微注射系统将已经加过接头和待测片段随机添加到玻璃FlowCell内，每一个FlowCell又被分成8条Lane，每条Lane的内表面上能以共价键的形式随机固定单链接头序列和带接头的单链待测DNA片段。,所有单链桥型待测片段扩增成双链桥片段，通过变性，释放出互补的单链，锚定到附近的固相表面。通过不断循环，将会在FlowCell的固相表面上获得上万条成簇分布的双链待测片段。,加入DNA聚合酶和被荧光标记的dNTP和接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。,Solexa技术特点：技术优势：测序性价比最高，运行成本低；可扩展的高通量；需要样品量少；简单、快速、自动化误差来源：每次添加核苷酸之前对荧光信号的切割，如果切割不完全，产生误差。（知道）,2.3.1、第三代测序技术：Heliscope单分子测序仪原理：将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子并且在每个片段末端加上poly-A（多聚腺嘌呤核糖核苷酸）尾巴。通过poly-A和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片。最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上，采集