茎尖培养及植物脱毒技术 讲课1

茎尖培养及植物脱毒技术,教学目的与要求,了解培养无病毒苗木的意义,掌握培养无病毒苗木的技术,特别是茎尖脱毒原理和技术以及无病毒的鉴定技术.,主要讲授内容,一.无病毒苗木特点二.培养无病毒苗木的意义三.培养无病毒苗木的技术四.无病毒苗的鉴定五.脱毒苗的繁殖,无病毒苗木培育,近年来，随着园艺业的不断发展，病毒危害，日益为人们所重视。病毒病的危害给园艺生产带来巨大损失。草莓病毒曾使日本草莓生产遭到灭顶之灾；柑橘衰退病曾经毁灭了巴西大部分柑橘园；圣何罗州80%的甜橙因病毒死亡。迄今尚无有效药剂和处理可以治愈受侵染的植物，所以通过各种苗木的培养是预防病毒病的途径。,一.无病毒苗木特点,1.无病毒苗木生长块,枝叶旺盛,健壮,根系发达.2.它比普通苗木结果早1-2年.3.产量可提高30%-300%.4.排除了化学药剂对环境,人,畜造成的污染和危害.,脱毒苗与未脱毒苗比较,二.培养无病毒苗木的意义,1.据统计，危害花卉、蔬菜和果树等园艺作物的病毒达几百种。由于大多数园艺作物采用无性繁殖法，利用茎、根、枝、叶、芽等通过嫁接、分株、分球、扦插、压条等途径进行繁殖,而进行无性繁殖的种类，由于病毒通过营养体进行传递，在母株内逐代积累，危害严重。以种子进行繁殖的种类，大多可随世代的交替而去除病毒,故病毒只能危害一个世代。,培养无病毒苗木的意义,2.病毒的危害给园艺生产带来巨大损失，如我国主栽的梨普遍带毒,平均带毒率达86.3%，质量锐减，柑桔的衰退病曾经毁灭了巴西的大部分柑桔，它至今仍威胁着柑桔生产。马铃薯的十几种病毒，也是各地马铃薯生产基地的严重障碍。花卉上病毒危害，大大影响观赏价值，使球根类、宿根类花卉退化严重，花变畸形、变色。,培养无病毒苗木的意义,3.通过培育无毒苗木，可以使作物大幅度增产。例、马铃薯其次，可以提高作物品质，如除去葡萄卷叶病病原，会使葡萄果实含糖量和葡萄酒的品质得以提高。另外，无病毒苗木生长整齐一致，寿命大为延长。由于排除了化学药剂的应用，减少了污染，对防止公害，保护环境，生产绿色食品促进健康具有积极意义。,三.培养无病毒苗木的技术,1.通过热处理法获得无病毒苗木：基本原理;在高于正常的温度下，植物组织中的很多病毒可以被部分地或完全地钝化，但很少伤害甚至不伤害寄主组织。,培养无病毒苗木的技术,培养无病毒苗木的技术,材料:处理的材料可以是植株，也可以是接穗,休眠芽.,培养无病毒苗木的技术,方法:通过热水浸泡或湿热空气进行,恒温和变温处理进行,热水浸泡对休眠芽效果较好，湿热空气对活跃生长的茎尖效果较好，把旺盛生长的植物移入到1个热疗室中，在3540下处理.处理时间的长短，可由几分钟到数月不等。处理时，最初几天空气、温度应逐步增高，直到达到要求的温度为止。若钝化病毒所需要的连续高温处理会伤害寄主组织，则应当变温热处理。,培养无病毒苗木的技术,2、茎尖培养脱毒茎尖大小与脱毒关系很大，太大则脱毒效果差，过小则难成活，但脱毒效果好.大小:0.20.3mm为宜，带12个叶原基的茎尖作为培养材料，超过0.5mm效果差.,培养无病毒苗木的技术,原因:老叶片和成熟的组织和器官中病毒含量较高，而幼嫩的及未成熟的组织和器官病毒含量较低，生长点(0.10.3mm)则几乎不含或含病毒很少。这是因为病毒在维管系统运输且慢，而分生组织不存在维管系统、且分裂旺盛生长快，这样就使茎尖区域部分细胞没有病毒。,培养无病毒苗木的技术,方法：通过(低温、药物、热水、热空气等)，可以纯化病毒,提高脱毒效率。康乃馨用40高温处理68周，再分离1mm长的茎尖培养，则成功地除去了病毒。,茎尖培养生产无病毒苗流程,茎尖微体嫁接脱毒,3.对茎尖培养难于生根的木本果树，可以进行试管茎尖微体嫁接（茎尖嫁接是组织培养与嫁接方法相结合）。它是以试管中的幼小植株作砧木，将茎尖分生组织嫁接其上的一种脱毒方法。它比茎尖培养的成苗率高，同时生长速度也较快。,培养无病毒苗木的技术,它是将0.10.2mm的茎尖（常经过热处理之后采集）作为接穗，在解剖镜下嫁接到试管中培养出来的无病毒实生砧木上，并移栽到有滤纸桥的液体培养基中，茎尖愈合后开始生长，然后切除砧木上发生的萌蘖。,培养无病毒苗木的技术,等幼苗生长1个月左右，再移栽到培养土中，茎尖嫁接脱毒法最早在柑橘上获得成功，以后在苹果、桃、梨、葡萄等得到进一步应用。因其脱毒效果好，遗传变异小，无生根难问题，已成为木本果树植物的主要脱毒方法。,茎尖微体嫁接脱毒,具体方法如下：在上胚轴顶端开倒“T”字形切口，横切口约离顶1毫米，竖切口平行切两刀，将两刀间皮层挑去，使成一缺口。将新梢消毒后取出带12个叶原基的茎尖0.1-0.2mm大小作接穗用。,培养无病毒苗木的技术,嫁接苗木用液体滤纸桥培养基培养，成活率可达30-50%。植株在移入土壤之前至少应有两片展开的真叶。,茎尖微芽嫁接过程,培养无病毒苗木的技术,4、珠心胚脱毒：柑橘的珠心胚一般不带病毒，用组织培养的方法培养珠心胚，可得到无病毒的植株。,培养无病毒苗木的技术,柑橘类具有多胚性，多胚中只有一个胚是受精后产生的有性胚而其余是珠心细胞形成的无性胚，故称珠心胚，由蛛心胚培养的苗子为无病毒苗。因病毒通常是经维管束的韧皮部组织传播的，而珠心胚与维管束系统无直接联系。,培养无病毒苗木的技术,5.愈伤组织培养脱毒法：通过植物器官或组织诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再诱导分化芽，长成植株，可以获得脱毒苗，这在天竺葵、马铃薯、大蒜、草莓、枸杞等植物上已先后获得成功。,愈伤组织培育无病毒苗的机制,利用诱导各器官愈伤组织培育无病毒苗的机制，有以下几种：（a）病毒在植株体内不同器官或组织分布不均；（b）病毒复制能力衰退或丢失；（c）继代培养的愈伤组织产生抗性变异。,培养无病毒苗木的技术,抗病毒药剂脱毒通过在培养基内加入抗病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒复制它可脱除苹果茎沟病毒和苹果退绿叶斑病毒,苹果无病毒苗木培养过程,四.无病毒苗的鉴定,1.指示植物法。利用病毒在植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的标准.也叫枯斑测定法.专门选用以产生局部病斑的寄主为指示植物.用嫁接或摩擦等方法接种于敏感的指示植物上，观察是否发病，不发病者为无病毒苗。,病毒的鉴定方法,采用嫁接方法（对于果树）。,病毒的鉴定方法,方法（1）二重芽接法秋季将母本指示植物的芽嫁接在实生砧木的基部约10cm处，再将待植株的12个芽，嫁接在指示植物接芽的下方，两个芽相距23cm，如果待测定植株的芽不够用，也可以嫁接一块植皮。每种指示植物需嫁接45株待侧植株，接后检查成活率，未成活的要进行补接。,病毒的鉴定方法,（2）二重枝接法：早春芽萌发前，将指示植物的茎段嫁接在待植株的茎段上，再用腹接或劈接法，将这一组合嫁接在实生砧木上，管理与二重芽接法相同。,苹果病毒种类主要症状,a苹果绿皱果病毒：病株的幼果表面出现水渍状斑块，逐渐发展为凹凸不平畸形果，病部果皮逐渐形成木栓化呈锈色b苹果锈果类病毒锈果型：先从顶部出现淡绿色水渍状斑块，最后向果梗扩展成栓化锈斑与纵纹。花脸型：果实着色后表现红绿相间花脸状。锈果-花脸复合型：呈现有锈斑又有花脸的复合症状c苹果花叶病毒斑驳型：从小叶脉开始发生鲜黄色病斑，形状不规则，大小不一。环斑型,花叶型,条斑型,.镶边型.d.苹果茎沟病毒：木质部产生深褐色纵向陷条沟.e.苹果茎痘病毒：出现叶片反卷、皮层坏死等症状.,检测的木本指示植物,检测上列五种病毒的木本指示植物是：a）苏俄苹果（R12740-7A）：检测苹果褪绿叶斑病毒；b）司派227（Spy227）或光辉（Radiant）：检测苹果茎痘病毒；c）弗吉尼亚小苹果（Virginiacrab）：检测苹果茎沟病毒；d）兰蓬王（Lordlambourne）：检测苹果花叶病毒；e）国光（Ralls）：检测苹果锈果类病毒。,病毒的鉴定方法,2、外部形态观察法根据植物体感染病毒所表现出的典型症状，如花叶、变形、坏死及变质等外部形态进行鉴定。如番茄外部症状，表现为花叶，植株出现条纹，黄瓜果实畸形等，则可初步确定是由病毒引起的病。,血清学技术,3.血清学技术。植物病毒抗血清分为多克隆抗体和单克隆抗体,主要是依据沉淀反应原理.目前世界上已制备出40多种植物病毒单克隆抗体，我国制备出烟草花叶病毒、马铃薯Y病毒、黄瓜花叶病毒等20多种植物病毒单克隆抗体。,血清学技术,方法.用玻片_用毛细管滴5滴抗血清(加ck)_加被测植物液_静置30分_在40倍镜下观察_是否沉淀.,电镜技术,4.将染病组织制样，置于电子显微镜下观察，根据病毒质粒形态、大小、内含体等，诊断病毒种类。应用血清学与电镜相结合的免疫电镜技术（IEM。,电镜技术(扫描电镜),电镜技术(透射电镜),PCR用于植物病毒鉴定,5.PCR用于植物病毒鉴定与分类是先扩增植物病毒基因DNA或RNA的cDNA，再对扩增物（DNA）进行电泳或核酸杂交分析。PCR用于植物病毒的鉴定与分类，灵敏度高、特异性强、快速简便，特别当样品病毒含量低，血清学方法难以检出时，效果更好。,电泳或核酸杂交分析。,电泳仪,核酸序列分析技术,6.核酸序列分析技术。以植物的病毒基因组DNA或RNA的核酸序列比较其基因组的含量、大小、排列及功能，依此作为分类依据，应用前景广阔。,核酸序列分析技术,紫红色部分都是序列相同的。前面是几个是先头几个测序不太准的，不管它。中间有一个C变成了A，是突变。,分子标记技术。,7.分子标记技术。如限制性片断长度多态性（RFLP），扩增片断长度多态性（AFLP）及随机扩增多态性DNA（RAPD）技术正在用于病毒诊断，株系划分和抗性基因的定位和病毒亲缘关系的确定。,五.脱毒苗的繁殖,1.在无病毒苗繁殖过程中，最重要的是防止再感染。试管苗驯化过程中，要对基质进行消毒，以防治土壤病菌和线虫。对原种苗繁殖要防止蚜虫和叶蝉传毒，需要在网室内进行繁殖。前期要加强水肥管理，后期要进行控制。,脱毒苗的繁殖,2.种苗要在隔离的专用苗圃内进行繁殖，要离周围同样园至少3km。避免在栽过的重茬地繁殖无毒苗。并注意定期防治病虫。无病毒原种苗可供繁殖2年，以后再繁殖，则需要重新鉴定，确认无病毒后再繁殖。,脱毒苗的繁殖,3.前期要加强水肥管理，后期