蛋白质定量：(BCA法)

实验原理BCA(bicinchoninic acid)是一种稳定的水溶性复合物，在碱性条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子可以和BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的络合物，该复合物为水溶性，在562nm处显示强吸光性，在一定浓度范围内，吸光度与蛋白质含量呈良好的线性关系，制作标准曲线，因此可以根据待测蛋白在562nm处的吸光度计算待测蛋白浓度。实验准备1. BCA定量试剂盒：含A液和B液A液：BCA碱性溶液（配方：1%BCA二钠盐，0.4%氢氧化钠，0.16%酒石酸钠， 2%无水碳酸钠，0.95%碳酸氢钠，这些液体混合后再调PH至11.25） B液：4%硫酸铜2.牛蛋白血清（BSA）3.待测的蛋白样品实验步骤1.配置BCA工作液：将A液和B液摇晃混匀，按照A:B=50:1的比例配置BCA工作液，充分混匀。（BCA工作液室温下24h内稳定，故现用现配）2.配置不同浓度的标准蛋白液（BSA），1ug/ul，2.5 ug/ul，5 ug/ul，7.5 ug/ul，10 ug/ul，待测蛋白样品在什么溶液中，就用该溶液来稀释标准蛋白液（如待测样品溶于强RIPA裂解液，则用强RIPA裂解液来稀释标准蛋白液）。3.取空白组（0ug/ul BSA）各浓度的标准蛋白液5ul加入96孔板中，另取待测的蛋白样品5ul，加入96孔板。PS：上图加样的量仅作为参考，蛋白液和BCA工作液的比例符合即可。4.向各孔的蛋白液中加入300ul的BCA工作液，混匀，37度放置30分钟，（加样时应当动作轻柔，防止产生气泡影响读数）。PS：温度和放置时间可以调整，可在60度放置30分钟or室温放置2小时。5.静置结束后，冷却至室温，用酶标仪测定562nm出的吸光度，并制作标准曲线。6.根据待测样品的吸光度，比对标准曲线，计算蛋白的浓度。注意事项BCA法测定蛋白浓度时，吸光度可随时间的延长不断加深，且显色反应会随温度升高而加快，故如果浓度较低，适合较高温度孵育or延长孵育时间。标准蛋白液的加量应当准确，如果加量不准确，会导致制作出来的标准曲线出现偏差，影响待测样品的浓度计算，所以一方面需要用梯度稀释的方法来配置标准蛋白液，另一方面应使用精确度高的移液枪。A液和B液混合可能出现浑浊，此时应成分振荡混匀，最后可见透明溶液。为加快BCA法测定蛋白浓度的速度可以适当用微波炉加热，但切勿过热。当结果出现空白组本身就有较高的背景，可用Bradford法重新测定蛋白浓度。优缺点优点：测定快速简便，45分钟内完成准确灵敏,检测浓度为5-200 mg/ml干扰物质少，BCA法不受大部分样品中的去垢剂等化学物质影响，可兼容样品中高达5%的SDS，5%Triton X-100,5%的Tween 20在一定浓度范围内，有良好的线性关系检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝法蛋白定量缺点：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚不够蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果BCA蛋白定量和 Bradford法蛋白定量的区别：1、Bradford法测得的主要是碱性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA则没有选择性2、BCA法蛋白浓度定量是二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（biuret reaction），一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。Bradford法蛋白定量是染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465nm变为595nm，光吸收增加。蛋白质染料复合物具有高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1g蛋白。染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约需2min，结合物的颜色在1h内是稳定的。一些阳离子，如K+，Na+，Mg2+，(NH 4 ) 2 SO 4，乙醇等物质不干扰